本发明生物医药，具体涉及一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶及制备方法与应用。
背景技术：
1、目前，已有许多高分子水凝胶敷料被研究，其中一些水凝胶敷料已被批准用于临床伤口治疗与护理。人体各类伤口有其庞杂的发病机理和特殊微环境，但伤口愈合往往大致遵循以下四个修复阶段：止血、炎症、增殖和组织重塑。这四个阶段中发生任何异常都可能导致伤口恶化，如急性出血、感染、炎症、慢性伤口等。受到病理因素与外界环境的影响，人体部分伤口无法正常愈合，不能及时完成重建，发生了难愈合、反复感染的情况。最常见的慢性伤口包括感染性伤口、压疮、糖尿病足、静脉性溃疡等，这类伤口通常表现为炎症反应、高血糖、反复感染、组织缺氧、无法愈合等情况。长期以来，糖尿病慢性伤口难愈合的情况严重影响着糖尿病人的生活质量，伤口处的高血糖环境，湿润的微环境导致细菌等病原微生物大量繁殖，使得伤口创面感染加剧。人体自身的免疫系统无法短期清除伤口创面上的细菌等病原微生物，因此需要借助医用敷料或者外来药物来抗菌，普通医用敷料材料本身不具有或者外加的抗生素抗菌剂易产生耐药性，不足以应对创面表面的细菌感染，伤口组织部位的细菌感染通常会延迟伤口愈合过程，甚至会导致严重的危及生命的并发症。因此，必须开发一种具有抗菌能力并改善伤口愈合的伤口敷料，加速慢性伤口愈合。
2、具有三维多孔网络和高亲水性的水凝胶类伤口敷料在皮肤组织重建领域非常广泛，它可以保持湿润环境、与皮肤紧密贴合、有效吸收渗出物、促进氧气和营养物质的运输，更有利地实现药物装载。具有生物相容性、生物可降解性、天然抗菌特性的天然高分子材料如壳聚糖，透明质酸等在伤口愈合水凝胶制剂中应用非常广泛，但其应用环境限制、功能单一、机械性能差等满足不了特殊伤口的需求。壳聚糖(cs)作为一种天然多糖聚合物，是一种广泛使用的生物材料，来源于甲壳素的脱乙酰化，已被广泛用作伤口愈合的支架等组织修复中，并表现出许多显著的性能，包括良好的生物相容性、生物降解性、止血性能和抗菌性能。为了克服壳聚糖低溶解性的缺点，近年许多研究通过对壳聚糖进行接枝，解决其难溶特性并赋予其它特性。精氨酸(l-arg)是伤口愈合过程中的一种重要介质。据报道，l-精氨酸可以在伤口部位分别被一氧化氮合酶(nos)和精氨酸酶催化成一氧化氮(no)和鸟氨酸。同时no对伤口愈合具有很大的优势，如增强血管生成和杀灭细菌感染等，此外，鸟氨酸本身是脯氨酸产生的前体，是胶原蛋白合成的基质材料，因此有利于加速伤口修复。游离l-精氨酸已被广泛用作患者的补充剂，以促进伤口愈合。然而，精氨酸通过口服给药的生物利用率较低，疗效较差。目前很多伤口敷料更倾向于在伤口部位局部递送精氨酸，能够更大限度的发挥其疗效。将精氨酸与壳聚糖接枝，一方面能够提高壳聚糖的水溶性，提高其抑菌效果，加速伤口愈合。同时，合成的壳聚糖-精氨酸经冻干后，呈疏松多孔状，吸水性较强，具有较好的止血效果。因此，设计开发一种具有抗菌性能以及缓解伤口乏氧微环境的水凝胶制剂是糖尿病慢性伤口治疗中急需解决的问题。
3、此外，目前临床针对糖尿病慢性伤口的反复感染、愈合缓慢等问题仍采用添加抗生素等传统治疗方法，但近年来抗生素药物的耐药性限制了传统抗菌制剂的应用。近年来，mofs纳米酶因其低成本、高稳定性、多功能性成为了抗菌应用的热点，与传统抗生素不同，纳米酶不太会引起细菌耐药性。具有pod(过氧化物酶活性)活性的cu-mof纳米酶在感染性伤口治疗中有着显著的疗效具有较强的杀菌疗效。但在实际应用过程中，其催化活性仍然受到强酸微环境的限制。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供了一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶及制备方法与应用。本发明提出将具有抗菌活性的负载葡萄糖氧化酶(gox)的金属有机骨架mofs纳米酶与具有天然抗菌活性和促血管生成的壳聚糖-精氨酸天然高分子有机凝胶骨架材料相结合，通过引入温敏性凝胶基质泊洛沙姆，构建了一种具有温度敏感性的抗菌和促进伤口愈合的纳米水凝胶敷料。针对糖尿病伤口和感染伤口处反复感染，新生血管不良等问题，构建了一种响应伤口特殊微环境的抗菌和促进伤口愈合的凝胶制剂。
2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案为：
3、第一方面，本发明提供了一种壳聚糖-精氨酸止血材料，所述的壳聚糖-精氨酸止血材料由壳聚糖上氨基通过酰胺化反应修饰含有羧基的精氨酸获得。
4、进一步地，上述技术方案中，所述壳聚糖-精氨酸止血材料的制备方法，包括如下步骤：
5、将壳聚糖加入至1-2wt％的乙酸溶液中，搅拌至完全溶解，得到壳聚糖溶液；将精氨酸，1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)，n-羟基琥珀酰亚胺(nhs)溶解于1-2wt％的乙酸溶液中，将溶液ph值调为6-6.5，室温搅拌以活化羧基，得到精氨酸反应溶液；将精氨酸反应溶液加至壳聚糖溶液中，充分搅拌均匀后，室温下反应，将产物透析，冻干后得壳聚糖-精氨酸止血材料。
6、进一步地，上述技术方案中，所述的壳聚糖和1-2wt％乙酸溶液的比例为(0.8～1.2)：100g/ml；所述的精氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(0.7～1)：(2～3)；所述的精氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液在室温下搅拌以活化羧基的时间为1～4h；所述的精氨酸反应溶液和壳聚糖溶液反应时间为18～26h；所述的透析的时间为3～5天。
7、第二方面，本发明提供了一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶，所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶，包括葡萄糖氧化酶(gox)修饰的cu-mof过氧化物酶、所述壳聚糖-精氨酸止血材料(cs-arg)和泊洛沙姆(pluronic)；
8、所述的cu-mof/gox功能化的温敏水凝胶中泊洛沙姆的质量分数为15～20％，壳聚糖-精氨酸止血材料的质量分数为2～5％，葡萄糖氧化酶修饰的cu-mof过氧化物酶(cu-mof/gox)的浓度为80～120μg/ml。
9、本发明的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶为具有温度敏感性的抗菌和促进伤口愈合的纳米酶功能化的水凝胶敷料。
10、进一步地，上述技术方案中，所述的葡萄糖氧化酶(gox)修饰的cu-mof过氧化物酶中gox修饰在cu-mof过氧化物酶的外层。
11、由壳聚糖-精氨酸止血材料与泊洛沙姆混匀得到温敏凝胶基质，将葡萄糖氧化酶修饰的cu-mof过氧化物酶加入到温敏凝胶基质中，得到cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶。
12、第三方面，本发明提供了一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶的制备方法，包括以下步骤：
13、步骤1：cu-mof过氧化物酶的制备
14、称取cu(no3)2·3h2o、2-氨基对苯二甲酸溶于dmf中，超声溶解；称取pvp溶于dmf和无水乙醇的混合溶液中，超声至澄清，将上述两个溶液混合均匀后超声，进行水热反应，反应结束后，离心、洗涤，得到cu-mof过氧化物酶；
15、步骤2：cu-mof/gox纳米粒的制备
16、将cu-mof过氧化物酶，gox加于去离子水中，搅拌24h，离心洗涤后得gox/cu-mof纳米粒；
17、步骤3：cu-mof/gox功能化的温敏水凝胶的制备
18、将所述壳聚糖-精氨酸止血材料、泊洛沙姆溶液混合均匀后，充分溶胀，制得空白凝胶基质；将cu-mof/gox纳米粒均匀分散在空白凝胶基质中，搅拌、超声、混匀后，制得cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶。
19、进一步地，上述技术方案中，步骤1中，所述的cu(no3)2·3h2o和2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为：(2～5)：1。所述的cu(no3)2·3h2o和dmf溶液体积的比为1：(10～30)mol/l。所述的pvp和cu(no3)2·3h2o的比例是(1～5)：1g/mmol。所述的pvp的dmf和无水乙醇的混合溶液，dmf和无水乙醇的体积比为1：(0.5～1)，pvp和dmf的比例为1：(15～25)g/ml。所述的cu(no3)2·3h2o和2-氨基对苯二甲酸的dmf溶液与pvp的dmf和无水乙醇的混合溶液，均匀混合后超声时间为15～30min。所述的水热反应温度为100～120℃，反应时间为8～10h。所述的离心、洗涤为于5000～8000rpm离心5～7min，用无水乙醇洗涤3～5次，再于8000～11000rpm离心8～10min，用去离子水洗涤2～5次。
20、进一步地，上述技术方案中，步骤2中，所述的cu-mof过氧化物酶和gox的质量比为1：(1～3)。所述的搅拌的时间为24～48h。所述的洗涤的溶剂为去离子水，洗涤的次数为3～5次，离心的速度为6000～9000rpm，离心的时间3～8min。
21、进一步地，上述技术方案中，步骤3中，所述的泊洛沙姆包括泊洛沙姆407，泊洛沙姆188。所述的壳聚糖-精氨酸止血材料和泊洛沙姆溶液混合均匀后，充分溶胀的时间为24～48h。
22、第四方面，本发明提供了一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶或者所述的制备方法制备的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶在伤口愈合水凝胶敷料中的应用。
23、进一步地，上述技术方案中，所述伤口为感染伤口或糖尿病伤口。
24、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
25、本发明将gox负载在cu-mof上，gox能够将伤口全层皮肤缺损处将无毒的葡萄糖转化为丰富的葡萄糖酸和h2o2。产生的葡萄糖酸会降低整个伤口微环境的ph，具有类过氧化物酶活性的cu-mof可以显著激活。同时，生成的h2o2会被cu-mof催化释放出剧毒的·oh，从而起到抗菌作用。cu-mof/gox纳米酶引入伤口凝胶敷料中，赋予传统凝胶制剂的纳米酶疗效，同时满足伤口所需的湿润愈合环境，协同发挥凝胶敷料促进伤口愈合疗效。
26、本发明制备的水凝胶以精氨酸接枝的壳聚糖为凝胶基质，该凝胶基质具有有较好的抗菌效果，且生物相容性好，简单易得，该凝胶基质在感染伤口及糖尿病慢性伤口愈合中有广阔的应用前景。
27、本发明制备的水凝胶引入gox修饰的cu-mof过氧化物酶，能够响应糖尿病慢性伤口原位级联释放活性氧，并催化释放的l-arg产生no促进血管正常化，加速慢性伤口愈合。
1.一种壳聚糖-精氨酸止血材料，其特征在于，所述的壳聚糖-精氨酸止血材料由壳聚糖上氨基通过酰胺化反应修饰含有羧基的精氨酸获得。
2.根据权利要求1所述的壳聚糖-精氨酸止血材料，其特征在于，所述壳聚糖-精氨酸止血材料的制备方法，包括如下步骤：
3.根据权利要求2所述的壳聚糖-精氨酸止血材料，其特征在于，所述的壳聚糖和1-2wt％乙酸溶液的比例为(0.8～1.2)：100g/ml；所述的精氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：(0.7～1)：(2～3)；所述的精氨酸、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐、n-羟基琥珀酰亚胺的混合溶液在室温下搅拌以活化羧基的时间为1～4h；所述的精氨酸反应溶液和壳聚糖溶液反应时间为18～26h；所述的透析的时间为3～5天。
4.一种cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶，其特征在于，所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶包括葡萄糖氧化酶修饰的cu-mof过氧化物酶、权利要求1-3中任一项所述的壳聚糖-精氨酸止血材料和泊洛沙姆；
5.根据权利要求4所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶，其特征在于，葡萄糖氧化酶修饰在cu-mof过氧化物酶的外层。
6.一种权利要求4或5所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤1中，所述的cu(no3)2·3h2o和2-氨基对苯二甲酸的摩尔比为：(2～5)：1；所述的cu(no3)2·3h2o和dmf溶液体积的比为1：(10～30)mol/l；所述的pvp和cu(no3)2·3h2o的比例是(1～5)：1g/mmol；所述的pvp的dmf和无水乙醇的混合溶液中，dmf和无水乙醇的体积比为1：(0.5～1)，pvp和dmf的比例为1：(15～25)g/ml；所述的水热反应的温度为100～120℃，反应时间为8～10h；所述的离心、洗涤为于5000～8000rpm离心5～7min，用无水乙醇洗涤3～5次，再于8000～11000rpm离心8～10min，用去离子水洗涤2～5次。
8.根据权利要求6所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶的制备方法，其特征在于，步骤2中，所述的cu-mof过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的质量比为1：(1～3)；所述的cu-mof过氧化物酶和葡萄糖氧化酶的质量比为1：(1～3)；所述的搅拌的时间为24～48h；所述的洗涤的溶剂为去离子水，洗涤的次数为3～5次，离心的速度为6000～9000rpm，离心的时间3～8min；
9.一种权利要求4或5所述的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶或者权利要求6-8中任一项所述的制备方法制备的cu-mof/gox功能化壳聚糖-精氨酸温敏水凝胶在伤口愈合水凝胶敷料中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述伤口为感染伤口或糖尿病伤口。
