本发明涉及蛋白质工程领域，具体涉及一种利用5′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法。
背景技术：
1、微生物宿主细胞中如酶、抗体、受体等蛋白质的产生在生物技术领域中是特别有意义的。毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以利用甲醇作为唯一碳源作为一种蛋白表达系统。相比原核表达系统，毕赤酵母具有糖基化修饰的优势，但没有酿酒酵母常见的过糖基化问题。毕赤酵母系统是近年来发展很快的真核表达系统，与原核表达系统相比，它可以对表达的蛋白质进行翻译后加工、折叠和修饰，得到具有正确空间结构和较高生物学活性的重组蛋白。近年来，许多重组蛋白已在毕赤酵母中实现了高效表达，达到克级水平，但仍有多种蛋白表达量较低，提高毕赤酵母外源蛋白表达量成为降低工业化生产成本的关键。
2、毕赤酵母作为重要的工业应用菌株，提升其外源蛋白表达能力一直是研究的热点与难点。提高菌株外源蛋白表达量常用的技术手段有基因的密码子优化、信号肽优化、基因拷贝数优化和蛋白折叠分泌途径优化等，而鲜有研究从菌株转录/翻译水平出发来提高毕赤酵母的外源蛋白表达量。
3、目前提高基因转录的主要方式是使用强启动子或利用增强子提高基因的转录水平。除了启动子和增强子序列对基因转录的贡献，5′非翻译区(5′untranslatedregion，5′utr)也可以影响真核生物基因的表达量。5′utr具有稳定mrna、形成翻译起始复合体和促进蛋白质合成等作用。外源蛋白在酵母中表达受mrna5'端和3'端的utr序列的核苷酸序列及长度的干扰比较大，为保证外源蛋白的成功表达,目的基因5'端utr应该与aox1基因的mrna5'端utr尽量相似或保持一致，目前且没有报道过在毕赤酵母中表达磷脂酶、木聚糖酶和植酸酶时通过替换5'-utr来提高表达量的。
4、在如今的工业生物技术环境中，当目的蛋白质以工业产量生产时，目的蛋白质产率的微小改善就具有重大意义。因此，科研工作者都在追寻构建新的或改善的毕赤酵母表达系统，以获得增强的/增加的蛋白质表达/产生的能力。
技术实现思路
1、本发明旨在提供了一种利用5′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法。
2、本发明通过大量实验及现象发现，对以下三组5′utr进行组合，得到全新的5′-utr核酸序列能有效实现本发明的目的。
3、人工设计的5′utr：gcacacgctggaattctagtatact(seq id no:1)
4、烟草花叶病毒(tmv)来源的5′utr：gcttacaattactatttacaattaca(seq id no:2)
5、紫花苜蓿花叶病毒(amv)来源的5′utr：tttttttatttttaattttctttcaaatacttccaccatgg(seq id no:3)
6、在本发明的一些实施例中，本发明利用5′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，包括将5′-utr核酸序列功能性地连接到目的蛋白质编码序列的5′端的步骤，其中，所述5′-utr核酸序列由seq id no:1-3所示三组5′utr中的任意两组通过连接序列组合而成。
7、在本发明的一些实施例中，所述连接序列包括但不限于caacaa。
8、在本发明的一个具体实施例中，所述5′-utr核酸序列为seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示。
9、seq id no:4：gcacacgctggaattctagtatactcaacaagcttacaattactatttacaattaca。
10、seq id no:5：gcttacaattactatttacaattacacaacaagcacacgctggaattctagtatact。
11、seq id no:6：tttttttatttttaattttctttcaaatacttccaccatggca acaagcttacaattactatttacaattaca。
12、根据本发明的利用5′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其中，所述目的蛋白质为磷脂酶、木聚糖酶或植酸酶。
13、根据本发明的利用5′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其中，所述磷脂酶a的氨基酸序列如seq id no:7，所述磷脂酶c的氨基酸序列如seq id no:8所示，所述木聚糖酶的氨基酸序列如seq id no:9，所述植酸酶的氨基酸序列如seq idno:10所示。
14、seq id no:7,
15、wsaedkhkegvnshlwivnraidimsrnttlvkqdrvaqlnewrtelengiyaadyenpyydnstfashfydpdngktyipfakqaketgakyfklagesyknkdmkqaffylglslhylgdvnqpmhaanftnlsypqgfhskyenfvdtikdnykvtdgngywnwkgtnpeewihgaavvakqdysgivndntkdwfvkaavsqeyadkwraevtpmtgkrlmdaqrvtagyiqlwfdtygdr。
16、seq id no:8，
17、apadkpqvlasftqtsassqnawlaanrnqsawaayefdwstdlcsqapdn pfgfpfntacarhdfgyrnykaagsfdanksridsafyedmkrvctgytgeknt acnstawtyyqavkil。
18、seq id no:9，
19、qsfcssashsgqsvkvtgnkvgtiggvgyelwadsgnnsatfysdgsfsctfqnagdylcrsglsfdstktpsqigrmkadfklvkqnssnvgysyvgvygwtrsplveyyivdnwlspfppgdwvgnkkhgsftidgaqytvyentrtgpsidgdttfnqyfsirqqardcgtidisahfdqweklgmtmgklheakvlgeagnvnggasgtadfpyakvyigd。
20、seq id no:10，
21、qsepelklesvvivsrhgvraptkatqlmqdvtpdawptwpvklgwltprggeliaylghyqrqrlvadgllakkgcpqsgqvaiiadvdertrktgeafaaglapdcaitvhtqadtsspdplfnplktgvcqldnanvtdailsraggsiadftghrqtafrelervlnfpqsnlcfkrekqdescsltqalpselkvsadnvsltgavslasmlteifllqqaqgmpepgwgritdshqwntllslhnaqfyllqrtpevarsratplldliktaltphppqkqaygvtlptsvlfiaghdtnlanlggalelnwtlpgqpdntppggelvferwrrlsdnsqwiqvslvfqtlqqmrdktplslntppgevkltlagceernaqgmcslagftqivnearipacsl。
22、相比现有技术，本发明的有益效果在于：1.本发明突破性的采用发明提供的5′-utr核酸序列功能性地连接到目的蛋白质编码序列后，能有效地提高目的蛋白质的表达量。
1.一种利用5-′utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述方法包括将5′-utr核酸序列功能性地连接到目的蛋白质编码序列的5′端的步骤，其中，所述5′-utr核酸序列由seq id no:1、seq id no:2和seq id no:3中任意两个通过连接序列连接组成。
2.根据权利要求1所述的利用5′-utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述连接序列为caacaa。
3.根据权利要求1所述的利用5′-utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述5′-utr核酸序列如seq id no:4、seq id no:5或seq id no:6所示。
4.根据权利要求1所述的利用5′-utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述目的蛋白质为磷脂酶、木聚糖酶或植酸酶。
5.根据权利要求4所述的利用5′-utr在毕赤酵母表达系统中提高目的蛋白质表达量的方法，其特征在于，所述磷脂酶的氨基酸序列如seq id no:7或seq id no:8所示，所述木聚糖酶的氨基酸序列如seq id no:9所示，所述植酸酶的氨基酸序列如seq id no:10所示。
