本发明涉及基因工程，尤其涉及一种表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒及构建方法、应用。
背景技术：
1、鸡传染性支气管炎(infectious bronchitis，ib)是由鸡传染性支气管炎病毒(infectious bronchitis virus，ibv)引起的一种鸡的急性、高度传染性疾病。可以在鸡群中迅速传播，主要影响鸡的呼吸系统，但也可能影响消化系统和生殖系统。典型的症状可能包括呼吸困难、咳嗽、喷嚏、流涕、眼部和鼻部分泌物增多，还可能出现下蛋数量减少、蛋壳质量下降、蛋黄色素改变等问题。ibv对鸡类生产造成了严重的经济影响，因此对其进行有效的预防和控制是鸡类生产业的重要任务。目前，没有针对ibv的特效药物，预防和控制主要依赖于生物安全措施和疫苗接种。生物安全措施包括限制人员和设备的进入，定期清洁消毒，避免不同年龄的鸡混养等。疫苗免疫接种是预防和控制该病较为有效的措施之一。传统疫苗包括灭活苗和减毒活疫苗存在许多不足，如减毒疫苗的安全性差、有毒力返强的潜在危险以及保存条件苛刻等；灭活疫苗存在免疫力不持久，用量大且制备过程复杂，费用较高等缺点。因此，开发新型疫苗如亚单位疫苗、病毒活载体疫苗、dna疫苗、转基因植物可食用疫苗等逐渐成为疫苗领域研究的热点。
2、ibv是一种冠状病毒，其基因组是长度为27.6kb的不分节段的单股正链rna。病毒基因组从3′端到5′端编码结构蛋白和辅助蛋白，其编码顺序为刺突蛋白(spike protein，s蛋白)、辅助蛋白3a、3b、包膜蛋白(envelope protein，e蛋白)、膜蛋白m(membraneprotein，m蛋白)、辅助蛋白4b、5a、5b、核衣壳蛋白(nucleocapsid，n蛋白)、复制酶蛋白1a和1b。其中s蛋白是分子质量最大的可糖基化的蛋白，是构成冠状病毒粒子最表层纤突的主要成分，其n端有一段信号肽，可介导s蛋白进入细胞内质网进行糖基化。ibv的序列多样性主要是由包含抗原表位的s蛋白序列，其中s1蛋白位于病毒粒子表面，其上含有中和表位及抗原决定基，参与保护性免疫应答及决定病毒细胞和组织嗜性。此外，s1基因是有效诱导病毒中和抗体、血凝抑制抗体、参与细胞吸附、血清型特异性的主要免疫原基因，同时也是ibv结构蛋白中变异程度最大的结构蛋白。
3、中国专利申请202310423761.7公开了一种包含猪德尔塔冠状病毒免疫蛋白的重组腺病毒载体和毒株、疫苗和应用，该方案以人复制缺陷型腺病毒载体为骨架载体，包括s蛋白或s1蛋白的编码基因；所述s蛋白或s1蛋白的编码基因来自ch/xjyn/2016毒株，进一步观察该方案的说明书可见，首先该方案对s蛋白或s1蛋白的编码基因进行了密码子的优化，提升了上述的s蛋白或s1蛋白的表达量，进一步观察该方案的重组病毒的制备过程可以看到，该方案先通过无缝克隆的方式将目的基因序列与pdc316连接，得到携带目的基因的穿梭质粒pdc-pd-tpa-sopt，最后将穿梭质粒转染，得到表达猪德尔塔冠状病毒免疫蛋白的重组腺病毒；
4、由上述方案可见，一方面该方案中将目标基因与穿梭质粒的连接方式为无缝克隆的连接方式，而非同源重组，另一方面，该方案中所使用的系统为admax系统，后期包装时需要将腺病毒的骨架质粒(pbhgloxδe1,3cre)与穿梭质粒共同转染hek293细胞。
5、本方案需要解决的问题：如何提供一种表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒。
技术实现思路
1、本申请的目的是提供一种表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒，此外，本申请还提供了上述表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒用于制备疫苗的用途。
2、为实现上述目的，本方案提供了一种表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒，所述表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒通过引物组对载有s1蛋白基因的质粒fused pfastbac1-c-s1egfp的质粒扩增，得到携带同源臂的s1蛋白基因，再将携带同源臂的s1蛋白基因插入穿梭质粒，得到载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒，随后将载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒与腺病毒同源重组、转染，得到表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒；
3、所述引物组包含上游引物pr-sf和下游引物pr-sr；
4、所述上游引物pr-sf的核苷酸序列如seq id no：1所示；
5、所述下游引物pr-sr的核苷酸序列如seq id no：2所示。
6、优选地，所述穿梭质粒为padtrack-goi。
7、此外，本申请还公开了一种用于构建上述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒的构建方法，包括以下步骤：
8、步骤1：利用上游引物pr-sf、下游引物pr-sr对载有s1蛋白基因的质粒fusedpfastbac1-c-s1 egfp扩增，得到携带同源臂的s1蛋白基因；
9、步骤2：将步骤1制得的携带同源臂的s1蛋白基因插入穿梭质粒，得到载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒；
10、步骤3：将步骤2制得的载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒与腺病毒同源重组、转染，得到表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒。
11、优选地，所述步骤1的反应体系为：1μl质粒fused pfastbac1-c-s1 egfp，1μl的上游引物pr-sf，1μl的下游引物pr-sr，10μl的5×primestar gxlbuffer，4μl的dntp mixture(2.5mm each)，1μl的primestar gxl dnapolymerase，32μl的灭菌水；
12、反应条件为：98℃～10s，60℃～15s，68℃～90s，30cycles。
13、优选地，所述步骤2具体为：使用xho i和sali分别对步骤1制得的携带同源臂的s1蛋白基因以及穿梭质粒进行双酶切，并回收酶切产物，随后通过t4酶将回收产物连接，得到载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒。
14、优选地，步骤2的反应体系为：2μl的t4 dna ligase buffer(10×)，60ng(0.011pmol)的穿梭质粒的酶切产物、36ng(0.033pmol)的携带同源臂的s1蛋白基因的酶切产物，1μl的t4 dnaligase以及添加至体系总量为20μl的无菌水；
15、反应程序为：于pcr仪16℃孵育连接4.5h。
16、此外，本申请还公开了如上所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒用于制备疫苗的用途。
17、本申请的有益效果是：
18、本申请通过对引物组的扩增为s1蛋白基因添加同源臂，随后将带有同源臂的s1蛋白基因与穿梭质粒重组，再经同源重组、转染，得到一种携带s1蛋白基因并能够表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒，并且此种能够表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒纯化后的滴度达到1x107gfu/ml。
1.一种表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒，其特征在于，所述表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒通过引物组对载有s1蛋白基因的质粒fused pfastbac1-c-s1 egfp的扩增，得到携带同源臂的s1蛋白基因，再将携带同源臂的s1蛋白基因插入穿梭质粒，得到载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒，随后将载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒与腺病毒同源重组、转染，得到表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒；
2.根据权利要求1所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒，其特征在于，所述穿梭质粒为padtrack-goi。
3.一种用于构建权利要求1-2中任一所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
4.根据权利要求3所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤1的反应体系为：1μl质粒fused pfastbac1-c-s1 egfp，1μl的上游引物pr-sf，1μl的下游引物pr-sr，10μl的5×primestar gxl buffer，4μl的dntp mixture(2.5mm each)，1μl的primestar gxl dna polymerase，32μl的灭菌水；
5.根据权利要求3所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，所述步骤2具体为：使用xho i和sali分别对步骤1制得的携带同源臂的s1蛋白基因以及穿梭质粒进行双酶切，并回收酶切产物，随后通过t4酶将回收产物连接，得到载有携带同源臂的s1蛋白基因的重组穿梭质粒。
6.根据权利要求5所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒的构建方法，其特征在于，步骤2的反应体系为：2μl的t4 dna ligase buffer(10×)，60ng(0.011pmol)的穿梭质粒的酶切产物、36ng(0.033pmol)的携带同源臂的s1蛋白基因的酶切产物，1μl的t4 dna ligase以及添加至体系总量为20μl的无菌水；
7.如权利要求1-2中任一所述的表达ibv病毒s1蛋白的重组腺病毒用于制备疫苗的用途。
