本发明涉及一种基于底物通道效应的双功能酶突变体及应用，属于酶工程。
背景技术：
1、黄素腺嘌呤二核苷酸(flavine ademine dinucleotide，fad)是维生素b2的磷酸腺苷化活性形式，在生物体内主要以辅因子的形式参与多种生命活动，包括碳水、蛋白质、脂肪的代谢，同时维持绝大部分黄素蛋白的结构与功能。微生物和植物可以从头合成核黄素(riboflavin,rf)及fad，然而人和动物只能从食物中获取，fad缺乏会引发机体代谢紊乱，因此其高效合成及补充至关重要。目前fad合成方法主要有化学合成法、微生物发酵法和生物合成法，化学合成法专一性不强，收率低；生物合成法因总体产率及成本因素仍停留在研究水平。其受限的因素之一是最后一步关键酶黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶(flavineadenine dinucleotide synthetase,fads)活性较低，因此提升fads的活性进而实现fad的高效生物合成具有重要的科学意义及产业需求。
2、原核生物中，双功能酶fads由fmnat结构域(残基1-182)与rfk结构域(残基183-338)组成，后者负责催化rf生成黄素单核苷酸(fmn)，前者负责催化fmn生成最终产物fad，因此在fads由催化核黄素生成fad过程中，伴有中间产物fmn生成，提高底物中间产物fmn的利用效率，有利于提高酶的整体活性。
3、酶的定向进化能够在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性的酶的突变体的技术过程，然而该过程文库量大，筛选复杂。如何构建“小”而“精”的突变文库，减小筛选的工作量并且增强阳性突变体的概率是酶分子进化研究的难点。常规酶分子进化方法主要围绕底物活性中心附近氨基酸进行随机突变或组合突变，通常其筛选范围较为局限，且筛选迭代次数较多，工作量较大，最终筛选得到高活性突变体的阳性率较低。
技术实现思路
1、为解决上述技术问题，本发明提供了一种基于底物通道效应的双功能酶突变体及应用。本发明基于底物通道效应，以提升中间产物在fads的rfk模块及fmnat模块的传输效率进而提升酶活性为目标，通过对fads的结构进行分析，将一个单体fmnat结构域与临近的单体rfk结构域剖分出并分析其接触界面区域，构建fads在其接触界面位点的饱和突变体文库，建立高通量筛选方法和酶活测定方法，最终建立一种双功能酶突变体，并应用于筛选fads高活性突变体。
2、为了达到上述目的，本发明采用的技术方案包括；
3、第一方面，本发明提供一种双功能酶突变体，所述双功能酶突变体为以seq idno.1所示的野生型fads酶的氨基酸序列为参考序列，第204位的亮氨酸突变为缬氨酸；
4、或者以seq id no.1所示的野生型fads酶的氨基酸序列为参考序列，第204位的亮氨酸突变为组氨酸；
5、或者以seq id no.1所示的野生型fads酶的氨基酸序列为参考序列，第204位的亮氨酸突变为半胱氨酸。
6、本发明以产氨棒状杆菌来源fads酶为参考序列，围绕第一步催化功能模块rfk和第二步催化功能模块fmnat的底物传输效应进行酶工程设计，得到三种高活性黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶突变体。相较于野生型fads酶，这三种黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶突变体酶活更高，能有效实现黄素腺嘌呤二核苷酸的高效生物合成。
7、进一步地，上述技术方案中，野生型fads酶为产氨棒状杆菌来源的fads酶。
8、进一步地，上述技术方案中，所述双功能酶突变体的氨基酸序列为seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4。
9、第二方面，本发明提供一种编码所述双功能酶突变体的基因，编码氨基酸序列为seq id no.2的核苷酸序列为seq id no.6，编码氨基酸序列为seq id no.3的核苷酸序列为seq id no.7，编码氨基酸序列为seq id no.4的核苷酸序列为seq id no.8。
10、进一步地，上述技术方案中，所述基因为使用同义密码子替换的seq id no.6、seqid no.7或seq id no.8碱基序列。
11、第三方面，本发明提供一种重组表达载体，包含所述的基因。
12、第四方面，本发明提供一种重组工程菌株，含有所述的重组表达载体。
13、进一步地，上述技术方案中，所述工程菌株为大肠杆菌。
14、第五方面，本发明提供一种所述的双功能酶突变体在合成黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。
15、进一步地，上述技术方案中，以核黄素为底物，以所述双功能酶突变体为催化剂，将核黄素催化合成产物黄素腺嘌呤二核苷酸。
16、有益效果：
17、本发明涉及的底物通道效应，即一个酶催化产生的产物不经过溶液扩散过程直接到达另一个酶的活性中心进行下一轮催化反应，通常发生在双功能酶的不同分子或多酶体系之间。而本发明通过系统分析双功能酶fads的不同模块分子互作界面，基于两个功能模块间的底物通道效应建立了一种双功能酶突变体的高效设计策略，并应用于筛选获得fads高活性突变体。
18、本发明基于双功能酶的两个模块之间的底物通道效应，设计氨基酸突变能够显著提升中间产物fmn从第一个催化功能模块的离去效率；此外，基于该策略得到三种高活性黄素腺嘌呤二核苷酸合成酶突变体，该突变体是对核苷酸序列如seq id no.1所示的野生型fads酶进行突变，将第204位亮氨酸分别突变为缬氨酸、组氨酸或半胱氨酸(l204v、l204h、l204c)。
19、本发明公开了一种基于底物通道效应的fads突变体的构建策略及其在高效合成fad中的应用，表明204位氨基酸残基对fads的催化作用有较大影响，第204位亮氨酸分别突变为缬氨酸、组氨酸及半胱氨酸，能够显著影响底物通道效应，并促进中间产物fmn在两个催化模块的传输，进而提升中间产物的利用效率，最终相比于野生型fads的活性分别提高的2.3倍、1.9倍和1.7倍。本发明对该双功能酶两个催化模块的底物通道效应催化机理研究提供了科学基础，其高活性突变体提高了该酶的工业应用潜力。
1.一种双功能酶突变体，其特征在于，所述双功能酶突变体为以seq id no.1所示的野生型fads酶的氨基酸序列为参考序列，第204位的亮氨酸突变为缬氨酸；
2.根据权利要求1所述的双功能酶突变体，其特征在于，野生型fads酶为产氨棒状杆菌来源的fads酶。
3.根据权利要求1所述的双功能酶突变体，其特征在于，所述双功能酶突变体的氨基酸序列为seq id no.2、seq id no.3或seq id no.4。
4.一种编码权利要求3所述双功能酶突变体的基因，其特征在于，编码氨基酸序列为seq id no.2的核苷酸序列为seq id no.6，编码氨基酸序列为seq id no.3的核苷酸序列为seq id no.7，编码氨基酸序列为seq id no.4的核苷酸序列为seq id no.8。
5.根据权利要求4所述的基因，其特征在于，所述基因为使用同义密码子替换的seq idno.6、seq id no.7或seq id no.8碱基序列。
6.一种重组表达载体，其特征在于，包含权利要求4或5所述的基因。
7.一种重组工程菌株，其特征在于，含有权利要求6所述的重组表达载体。
8.根据权利要求7所述的重组工程菌，其特征在于，所述工程菌株为大肠杆菌。
9.权利要求1-3中任一项所述的双功能酶突变体在合成黄素腺嘌呤二核苷酸中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，以核黄素为底物，以所述双功能酶突变体为催化剂，将核黄素合成黄素腺嘌呤二核苷酸。
