本发明涉及3d生物打印，具体涉及一种用于3d生物打印的生物墨水及其制备方法。
背景技术：
1、3d生物打印是将含有细胞的生物墨水通过3d打印工艺精确制造活体结构的过程。3d生物打印为研究人员提供了一种可以创建具有复杂空间结构并更接近天然组织的生物结构的方法，也可以制造仿生活体3d结构以促进目标缺损组织的再生，以及构建体外组织/器官模型和药物筛选装置的有巨大价值的技术。3d生物打印的生物墨水一般采用的是高分子材料(特别是天然高分子材料)，因为它们可以模拟细胞外基质和微环境，并且它们可以在相对温和的环境条件下去解决系统中各种问题。目前，可以进行3d生物打印的增材制造技术有挤出式3d打印、光固化3d打印和喷墨打印等。生物3d打印一直存在着一个挑战：生物墨水的物理化学性质和生物学效应结果之间的权衡。一方面，在挤出式打印过程中，高粘度生物墨水有利于打印工艺，而高粘度的生物墨水在挤出过程中对细胞有较大剪切力，导致较低的细胞活力(约40％～80％)。另一方面，打印后培养期间，交联的水凝胶力学性能越高对支架的稳定性越有利，而对水凝胶中的细胞来说高交联度降低了其获取营养效率从而导致活性降低。喷墨打印要求降低的细胞密度以及仅限于3.5～12mpa·s的粘度范围。光固化生物打印具有较高打印精度和要求较低粘度的生物墨水的特点，因为工艺原理的原因，可以维持较高的细胞活性。光固化生物打印精度对生物墨水的要求较高，且长时间打印过程会导致细胞的沉降，这些问题限制了其在组织再生领域的发展。目前，很少生物墨水能够同时满足必要流变特性的可打印性和理想细胞调控微环境功能的要求。因此，开发一种可打印性高和可调控细胞行为并维持细胞活性的生物墨水是3d生物打印再生修复领域亟待解决的问题。
技术实现思路
1、为了解决现有技术存在的上述不足，本发明的目的是提供一种用于3d生物打印的生物墨水及其制备方法，以解决现有3d生物打印生物墨水存在可打印性和细胞生物活性不可兼得，同时在时空上缺乏精准调控细胞行为的问题。
2、本发明解决上述技术问题的技术方案如下：提供一种用于3d生物打印的生物墨水，包括以下体积百分数的组分：载细胞水凝胶微球60％～90％和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水10％～40％。
3、本发明的有益效果为：本发明中的多孔墨水具有多孔结构，有利于细胞的粘附、增殖和迁移。载细胞水凝胶微球中载的细胞能够在微球中停留一段时间，期间细胞可以进行增殖、分化等行为，随后可逐渐迁移出微球，可紫外光固化多孔墨水中含有紫外光引发剂，在紫外光下发生反应后，可固化形成微孔，迁出载细胞水凝胶微球的细胞都迁移至可紫外光固化多孔墨水固化后的微孔内进行大量增殖，最后在多孔墨水的诱导下进行分化行为。由此可知，本发明提供的用于3d生物打印的生物墨水可在时空尺度上调控细胞的行为。此外，载细胞水凝胶微球占生物墨水的体积百分比为60％～90％，可紫外光固化多孔墨水占生物墨水的体积百分比为10％～40％，载细胞水凝胶微球和可紫外光固化多孔墨水以上述特定比例组合构建的生物墨水具有良好的流变性能，有利于3d打印工艺，同时可维持细胞的生物活性。
4、在上述技术方案的基础上，本发明还可以做如下改进：
5、进一步，上述生物墨水包括以下体积百分数的组分：载细胞水凝胶微球80％和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水20％；或载细胞水凝胶微球60％，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水40％；或载细胞水凝胶微球40％，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水60％。
6、进一步，载细胞水凝胶微球包括细胞、高分子材料和乳化剂；高分子材料为甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种。
7、采用上述进一步技术方案的有益效果为：高分子材料为生物形容性良好的材料，为细胞提供仿生的细胞外基质微环境，并且高分子材料还提供了生物墨水的流动性和可塑性，使得生物墨水能够在打印过程中均匀流动，并在固化后形成所需的形状和结构。
8、进一步，载细胞水凝胶微球中高分子材料的浓度为2％～10％(w/v)，乳化剂的浓度为1％～5％(w/v)。
9、进一步，乳化剂为span80。
10、进一步，载细胞水凝胶微球的直径为50μm～200μm。
11、采用上述进一步技术方案的有益效果为：该直径的载细胞水凝胶微球可以很好地维持3d打印过程中的打印活性及打印精度。
12、进一步，载细胞水凝胶微球中的细胞为可分化或转分化的细胞。
13、进一步，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水包括以下质量体积百分比的组分：高分子材料10％～30％、光引发剂0.02％～0.1％和聚环氧乙烷1％～5％，余量为水；其中，高分子材料为甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种；聚环氧乙烷的分子量为10～50万。
14、采用上述进一步技术方案的有益效果为：光引发剂为紫外光引发剂，是一种能够在紫外光照射下引发化学固化反应的物质。当紫外光照射到生物墨水中的紫外光引发剂时，它会产生自由基或离子，引发高分子材料发生交联反应，这种固化反应能够使生物墨水迅速干燥和固化，形成稳定的结构，以及提高生物墨水的附着性。聚环氧乙烷为造孔剂，也可以起到增稠和粘附的作用，可以调整生物墨水的粘度，跟高分子材料一同控制墨水在打印过程中的流动性，并提高生物墨水在打印介质上的粘附能力。
15、进一步，光引发剂为紫外光引发剂，如苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂(lap)或irgacure 2959。
16、采用上述进一步技术方案的有益效果为：光引发剂能够在紫外光的激发下诱导可紫外光固化多孔墨水中的高分子材料进行交联反应形成多孔水凝胶，同时紫外光固化过程温和，减少了细胞毒性。
17、进一步，光引发剂浓度优选0.5％；聚环氧乙烷浓度优选3.2％
18、进一步，上述用于3d生物打印的生物墨水还包括掺入载细胞水凝胶微球或多孔墨水以形成异质微环境的无机高分子材料或生化因子。
19、采用上述进一步技术方案的有益效果为：用于3d生物打印的生物墨水除了一种载细胞水凝胶微球模块和可紫外光固化多孔墨水模块外，还可以包含其他模块，为细胞提供异质微环境，即为细胞提供不同的微环境促使细胞在不同的微环境中产生各自的细胞行为，从而可以通过生物墨水调控细胞行为并维持较高的生物活性。
20、进一步地，无机高分子材料为羟基磷灰石、磷酸三钙和生物玻璃中的至少一种。
21、采用上述进一步技术方案的有益效果为：羟基磷灰石、磷酸三钙和生物玻璃具有良好的生物相容性，生物降解性和骨诱导性，在异质微环境中构建了促使细胞成骨分化的微环境。
22、进一步地，生化因子为去铁胺、菲咯啉和三碘甲状腺原氨酸中的至少一种。
23、采用上述进一步技术方案的有益效果为：去铁胺和菲咯啉具有促进血管化的性能，在异质微环境中构建了促使细胞成血管分化的微环境。三碘甲状腺原氨酸具有促进软骨细胞肥大的功能，在异质微环境中构建了促进细胞肥大化的功能。
24、上述用于3d生物打印的生物墨水的制备方法，包括以下步骤：
25、将载细胞水凝胶微球和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水混合，制得用于3d生物打印的生物墨水。
26、进一步地，载细胞水凝胶微球的制备方法包括以下步骤：将细胞分散于高分子材料溶液中，然后加入含有乳化剂的液体石蜡，混匀得悬浊液，将悬浊液进行光固化，离心，去除上清液后，制得载细胞水凝胶微球。
27、进一步地，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水的制备方法包括以下步骤：
28、将高分子材料溶于含一半引发剂的磷酸盐缓冲液中，得高分子材料水溶液；
29、将聚环氧乙烷溶于含一半引发剂的磷酸盐缓冲液中，制得聚环氧乙烷溶液；
30、将高分子材料水溶液和聚环氧乙烷溶液按体积比为1：1混合，制得含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水。
31、采用上述进一步技术方案的有益效果为：含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水中的多孔就是由高分子材料水溶液和聚环氧乙烷溶液共混后进行光固化，高分子材料交联而聚环氧乙烷不交联，从而形成多孔结构。孔径是通过高分子材料水溶液和聚环氧乙烷溶液的体积比调控，聚环氧乙烷溶液的体积越大，孔径越大，本发明中将高分子材料水溶液和聚环氧乙烷溶液按体积比为1：1混合，既有连续贯通的微孔，又能拥有良好的力学性能。
32、本发明具有以下有益效果：
33、(1)本发明提供的生物墨水至少含有2个模块，分别为载细胞水凝胶微球模块和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水模块。载细胞水凝胶微球为细胞提供良好的保护，维持较高的细胞活性，并为细胞提供初步的可调节微环境；含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水模块可以调控细胞的行为如诱导细胞进行增殖分化等行为。除了上述模块外，还可以加入其它不同的模块构成多孔异质微环境，多孔异质微环境可提供不同的微环境，促使细胞在不同的微环境中产生各自的细胞行为。
34、(2)本发明制得的生物墨水具有可调控的流变学行为，在载细胞微球高体积百分比的情况下具有剪切变稀和较高粘度的性质，可以应用于挤出式3d打印；在载细胞微球较低体积百分比的情况下具有低粘度性质，可以应用于光固化3d打印工艺。另外，多孔墨水可以提供良好的力学稳定性，有利于3d打印工艺的成型保真度。
35、(3)本发明提供的制备载细胞微球的方法，有利于维持较高的细胞活性且具有较高的生产载细胞微球效率。另外，本发明提供的制备多孔墨水的方法兼具低粘度和高力学性能的特征，同时也有大量多孔结构促进细胞的增殖、粘附和迁移。
1.一种用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，包括以下体积百分数的组分：载细胞水凝胶微球60％～90％和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水10％～40％。
2.根据权利要求1所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，包括以下体积百分数的组分：载细胞水凝胶微球80％和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水20％；或载细胞水凝胶微球60％，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水40％；或载细胞水凝胶微球40％，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水60％。
3.根据权利要求1或2所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，载细胞水凝胶微球包括细胞、高分子材料和乳化剂；高分子材料为甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，载细胞水凝胶微球中高分子材料的浓度为2％～10％(w/v)，乳化剂的浓度为1％～5％(w/v)。
5.根据权利要求4所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，乳化剂为span80。
6.根据权利要求1或2所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水包括以下质量体积百分比的组分：高分子材料10％～30％、光引发剂0.02％～0.1％和聚环氧乙烷1％～5％，余量为水；其中，高分子材料为甲基丙烯酰化明胶、甲基丙烯酰化丝素蛋白、甲基丙烯酰化海藻酸钠、甲基丙烯酰化透明质酸和聚乙二醇二丙烯酸酯中的至少一种；光引发剂为苯基-2,4,6-三甲基苯甲酰基膦酸锂或irgacure2959；聚环氧乙烷的分子量为10～50万。
7.根据权利要求1或2所述的用于3d生物打印的生物墨水，其特征在于，还包括掺入载细胞水凝胶微球或多孔墨水以形成异质微环境的无机高分子材料或生化因子；无机高分子材料为羟基磷灰石、磷酸三钙和生物玻璃中的至少一种；生化因子为去铁胺、菲咯啉和三碘甲状腺原氨酸中的至少一种。
8.权利要求1～7任一项所述的用于3d生物打印的生物墨水的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将载细胞水凝胶微球和含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水混合，制得用于3d生物打印的生物墨水。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，载细胞水凝胶微球的制备方法包括以下步骤：将细胞分散于高分子材料溶液中，然后加入含有乳化剂的液体石蜡，混匀得悬浊液，将悬浊液进行光固化，离心，去除上清液后，制得载细胞水凝胶微球。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，含光引发剂的可紫外光固化多孔墨水的制备方法包括以下步骤：
