本发明属于医药卫生，具体涉及一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统及其制备方法。
背景技术：
1、一直以来，外周神经损伤后修复一直是临床治疗和研究的难点，神经损伤修复过程中，雪旺细胞具有极其重要的作用，但其自我增殖能力弱，还会引起供区创伤等；近年来，干细胞在组织修复过程中的价值逐渐受到重视，一些干细胞可以分化为神经系细胞，还能分泌酸性钙结合蛋白s100、胶质纤维酸性蛋白(gfap)、神经生长因子(ngf)等，在自身分化为神经组织结构细胞的同时还能加速神经组织的生长和修复，为外周神经损伤的修复提供了新的治疗思路，脂肪干细胞(adscs)最早是从脂肪组织中分离的一类多能性干细胞，具有来源广泛、取材容易、便于自体移植等优点，因此日益受到研究者的关注。
2、众多研究结果显示，在不同的微环境下和不同神经营养因子刺激下，adscs可以对外周神经损伤进行较好的修复，同时其来源丰富、取材方便，已被认为是临床构建组织工程化神经最理想的种子细胞之一。神经营养因子对于促进外周神经损伤后轴索再生具有重要意义，大量研究表明，gdnf(胶质细胞源性神经营养因子)不仅能促进损伤神经运动及感觉神经元存活，而且有利于损伤神经突触重建，促进损伤神经修复。神经损伤后，其远端及去神经支配的肌肉gdnf表达急剧增高，且从远端至近端呈梯度性降低，这种梯度性gdnf表达作为信号引导轴索向靶器官生长。然而神经损伤后，施旺细胞及神经元大量凋亡，不足以合成足够gdnf促进轴索生长进入靶器官。外源性输注gdnf一定程度上能促进损伤神经轴索再生，持续稳定靶向给药，有利于损伤神经修复，但很难模拟出生理状态神经损伤后梯度性gdnf表达信号，且外源性输注或生物支架负载的gdnf无法长时间存活并发挥生物学效应。
3、因此，建立适宜的gdnf生物输注系统至关重要，基因治疗是理想方案。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题在于针对上述现有技术的不足，提供一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统。该自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统在一定时间内自内而外的局部持续缓释神经源性生长因子gdnf，促进adsc细胞向雪旺细胞分化，同时过表达gdnf的adscs可以分泌nt-3、bdnf、cntf、gfap等神经损伤修复相关因子，修复周围损伤神经，并解决了雪旺细胞来源有限，增殖能力弱的缺点，同时自体prp联合自体脂肪干细胞可以有效的降低患者的自身免疫反应、促进坐骨神经和外周神经损伤修复的技术难题。
2、为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，该系统为将prp加入胶原质和凝血酶，形成不规则微观三维立体网格结构，并在所述网格结构上负载过表达gdnf的脂肪干细胞。
3、本发明利用prp(富血小板血浆)可以形成自体凝胶，将prp加入胶原质和凝血酶，prp在凝血酶的作用下与胶原质形成不规则微观三维立体网格结构的凝胶，在此网格结构上负载过表达gdnf的脂肪干细胞，过表达gdnf的脂肪干细胞会在这些网格中生长，因为接种的过表达gdnf的脂肪干细胞是经病毒感染后稳定表达gdnf的脂肪干细胞，所以，过表达gdnf的脂肪干细胞细胞会在凝胶中生长的同时分泌释放gdnf，gdnf不仅能促进损伤神经运动及感觉神经元存活，而且有利于损伤神经突触重建，促进损伤神经修复，同时又极大促进脂肪干细胞向雪旺细胞分化，促进外周神经损伤修复。
4、本发明过表达gdnf的脂肪干细胞来源于自体脂肪组织，就是把gdnf这个基因通过病毒导入脂肪干细胞，然后过表达gdnf的脂肪干细胞在凝胶的孔径中生长，细胞通过增殖分化的过程，同时释放gdnf这个生长因子，gdnf随着细胞的生长释放。
5、上述的一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，所述网格结构中网格的直径为20μm～200μm。本发明中脂肪干细胞大小大概在10μm～100μm，神经细胞会稍大一些，通过控制网格结构中网格的直径为细胞的生长提供足够的面积和空间，为细胞的黏附、迁移和增殖提供环境支持。
6、上述的一种自体prp负载过表达gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，所述过表达gdnf的脂肪干细胞缓释分泌gdnf，分泌的gdnf刺激脂肪干细胞向雪旺细胞分化，同时，释放神经损伤修复相关因子。本发明中过表达gdnf的脂肪干细胞可以缓释gdnf生长因子，在促进脂肪干细胞向雪旺细胞分化中发挥重要的作用，过表达gdnf的脂肪干细胞可以分泌nt-3(生长因子)、bdnf(脑源性神经营养因子)、cntf(睫状神经营养因子)、gfap(胶质纤维酸性蛋白)等神经损伤修复相关因子。
7、另外，本发明提供了一种制备自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
8、步骤一、prp制备：将sd大鼠进行prp获取，得到prp；
9、步骤二、过表达gdnf的脂肪干细胞制备：将细胞融合度为40％～60％的第三代脂肪干细胞进行感染，得到过表达gdnf的脂肪干细胞；
10、步骤三、自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统的制备：将步骤二中得到的prp加入胶原质中充分混合，然后加入步骤一中得到的过表达gdnf的脂肪干细胞并充分混匀，最后加入凝血酶进行混匀，混匀后即刻将混合液加入细胞培养板并放入细胞培养箱培养，形成自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，凝胶形成后，向培养板中再加入完全培养基继续进行细胞培养。
11、上述的方法，其特征在于，步骤一中所述prp获取的过程为：将5只sd大鼠采用质量分数为1％的戊巴比妥钠腹腔麻醉，然后在严格无菌条件下采心脏血，将全血收集至柠檬酸钠抗凝管中，颠倒混匀，立刻以900g的离心力离心5min，取出离心管，管中分为三层，上层为血浆，中间层为prp，最底层为红细胞，将上层和中间层转移至新离心管，以1500g的离心力离心15min，再采用无菌注射器抽出上清液总体积的1/2～3/4弃之，剩余为prp；所述离心过程中离心机提前进行4℃预冷。
12、上述的方法，其特征在于，步骤二中所述第三代脂肪干细胞的制备方法为：取进行prp获取后的sd大鼠的腹股沟脂肪，然后经过酶消化法，原代培养、鉴定，获得第三代脂肪干细胞。本发明将步骤一中取完prp后的sd大鼠进行再取脂肪进行脂肪干细胞培养，等于是采用自体的prp和脂肪干细胞，强调自体，是因为为了后期应用临床，临床上抽取病人少量血液获取prp，然后，获取脂肪进行细胞培养，最后移植会体内，自体的话就避免了免疫排斥反应，降低了免疫原性，提高了治疗效果。
13、上述的方法，其特征在于，步骤一中所述感染的过程为：在感染前1h，将第三代脂肪干细胞的培养基更换为无抗生素的完全培养基，然后用腺病毒感染8h～12h后更换回含有10％fbs的dmem/f12完全培养基，得到过表达gdnf的脂肪干细胞；所述过表达gdnf的脂肪干细胞的感染效率为80％～90％，最佳感染复数moi＝1000。本发明中更换培养基是为了减轻病毒对细胞的毒性，如果细胞状态良好，可以选择不用换液，本发明中用腺病毒感染8h～12h后更换回含有10％fbs的dmem/f12完全培养基，之后随着细胞的增殖、分裂，过表达gdnf的脂肪干细胞不断增加，换回完全培养基仍然处在感染过程，总时间为48-72h，得到过表达gdnf的脂肪干细胞，本发明中gdnf在设计用病毒感染导入细胞时，载体上带绿色荧光标记，当gdnf被成功导入的细胞，细胞会带绿色荧光，荧光显微镜下可以观测到绿色荧光，且细胞生长良好，得到过表达gdnf的脂肪干细胞。
14、上述的方法，其特征在于，步骤三中所述prp的体积、胶原质的质量和过表达gdnf的脂肪干细胞的体积比为10：1：0.2，所述体积的单位为ml，质量的单位为g，所述过表达gdnf的脂肪干细胞的细胞数为1×106个/ml，所述凝血酶的加入量为10u，所述细胞培养板为24孔板，每个孔的容积为1ml，所述培养箱内的温度为37℃，所述凝胶形成的时间为10min～20min。
15、本发明与现有技术相比具有以下优点：
16、1、本发明采用将prp加入胶原质和凝血酶，调整相关参数以形成20μm～200μm的不规则微观三维立体网格结构，在此基础上，负载过表达gdnf的脂肪干细胞，以局部应用缓释神经源性生长因子gdnf，prp负载的gdnf-脂肪干细胞在可以局部释放大量的gdnf，并gdnf刺激脂肪干细胞向雪旺细胞分化的同时，分泌神经损伤相关生长因子，从而，有望开展prp联合缓释gdnf-脂肪干细胞局部应用治疗外周神经损伤，从根本上改变传统神经损伤相关因子的全身或局部使用方式，以进一步提高防治外周神经损伤的疗效，该技术的探索成功将对提高外周神经损伤修复的救治成功率，安全性高，降低残疾率和死亡率具有重大临床意义。
17、2、本发明建立了适宜的gdnf生物输注系统，是基因治疗的理想方案，将外源性gdnf基因稳定转染进大鼠adscs构建成adscs-gdnf，随后利用自体prp凝胶混合adscs-gdnf治疗外周神经损伤(坐骨神经电损伤)，取得了显著的修复和功能恢复，具有重要的临床应用价值；细胞学检测显示，在自体prp凝胶+gdnf的刺激下，adscs向施旺细胞分化增强同时其自身合成gdnf量显著升高，因此自体prp负载gdnf促adscs向施旺细胞分化及功能成熟是上述新型生物材料治疗外周神经损伤的关键步骤，这一新型生物材料值得临床应用和推广。
18、3、本发明采用自体prp避免了免疫排斥反应，降低了免疫原性，提高了治疗效果。
19、4、本发明中prp负载过表达gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，这个凝胶是立体多孔结构，适合细胞生长，给细胞提供良好的生长环境，保证了gdnf的缓释释放。
20、下面通过附图和实施例对本发明的技术方案作进一步的详细描述。
1.一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，该系统为将prp加入胶原质和凝血酶，形成不规则微观三维立体网格结构，并在所述网格结构上负载过表达gdnf的脂肪干细胞。
2.根据权利要求1所述的一种自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，所述网格结构中网格的直径为20μm～200μm。
3.根据权利要求1所述的一种自体prp负载过表达gdnf-脂肪干细胞凝胶系统，其特征在于，所述过表达gdnf的脂肪干细胞缓释分泌gdnf，分泌的gdnf刺激脂肪干细胞向雪旺细胞分化，同时，释放神经损伤修复相关因子。
4.一种制备如权利要求1～3中任一权利要求所述的自体prp负载缓释gdnf-脂肪干细胞凝胶系统的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤一中所述prp获取的过程为：将5只sd大鼠采用质量分数为1％的戊巴比妥钠腹腔麻醉，然后在严格无菌条件下采心脏血，将全血收集至柠檬酸钠抗凝管中，颠倒混匀，立刻以900g的离心力离心5min，取出离心管，管中分为三层，上层为血浆，中间层为prp，最底层为红细胞，将上层和中间层转移至新离心管，以1500g的离心力离心15min，再采用无菌注射器抽出上清液总体积的1/2～3/4弃之，剩余为prp；所述离心过程中离心机提前进行4℃预冷。
6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤二中所述第三代脂肪干细胞的制备方法为：取进行prp获取后的sd大鼠的腹股沟脂肪，然后经过酶消化法，原代培养、鉴定，获得第三代脂肪干细胞。
7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤二中所述感染的过程为：在感染前1h，将第三代脂肪干细胞的培养基更换为无抗生素的完全培养基，然后用腺病毒感染8h～12h后，更换回含有10％fbs的dmem/f12完全培养基，得到过表达gdnf的脂肪干细胞；所述过表达gdnf的脂肪干细胞的感染效率为80％～90％，最佳感染复数moi＝1000。
8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤三中所述prp的体积、胶原质的质量和过表达gdnf的脂肪干细胞的体积比为10：1：0.2，所述体积的单位为ml，质量的单位为g，所述过表达gdnf的脂肪干细胞的细胞数为1×106个/ml，所述细胞培养板为24孔板，每个孔的容积为1ml，所述培养箱内的温度为37℃，所述凝胶形成的时间为10min～20min。
