本发明涉及免疫学检测领域，特别是涉及一种快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用。
背景技术：
1、猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus，pdcov)是新发现的一种新型猪肠道冠状病毒，可感染所有日龄的猪，主要引起10日龄以内的仔猪发生急性腹泻、呕吐和新生仔猪死亡。2021年12月《nature》期刊报道，从海地的三名发热儿童血清样本中检测并分离到了猪δ型冠状病毒，表明猪丁型冠状病毒具有感染人的风险。目前尚无疫苗投放市场，快速准确地疾病诊断对于该病的防控至关重要。
2、引起猪肠道腹泻的病原有多种，且许多腹泻类疾病症状相似，实验室诊断是判断病猪是否感染pdcov的主要手段。常用的检测pdcov的主要实验室检测技术包括：病毒分离和鉴定、血清学检测、免疫学和分子生物学方法。然而，这些方法周期长、操作复杂繁琐，需要专业的技术人员和特定的仪器才可以完成，很难满足临床样品的快速、廉价、高效监测的要求。因此，亟需一种检测pdcov的新方法，以提高检测效率。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒及其应用，以解决上述现有技术存在的问题，以免疫磁珠为捕获pdcov特异性的igg抗体、辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪多克隆抗体(hrp-conjugated affinipure goat anti-swine igg(h+l))为检测抗体，可以在免疫磁珠上形成“pdcov-n蛋白-pdcov-n特异性igg抗体-酶标记抗体”三聚体复合物，通过底物颜色变化和吸光度值的测定即可直接判定结果，方便高效且成本低，可以明显提高检测效率。
2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：
3、本发明提供一种快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，所述试剂盒包括免疫磁珠，所述免疫磁珠为磁珠与猪δ冠状病毒n蛋白偶联制得；
4、所述试剂盒以所述免疫磁珠作为捕获抗原，hrp标记的山羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体，检测待测样品中是否含有猪δ冠状病毒igg抗体。
5、优选的是，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：
6、将磁珠用1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和n-羟基丁二酰亚胺的混合液进行活化；
7、用包被液稀释猪δ冠状病毒n蛋白后，再与活化后的磁珠进行偶联，将n蛋白包被在活化后的磁珠表面，然后用封闭液封闭所述磁珠上未结合的位点，制得所述免疫磁珠。
8、优选的是，所述磁珠进行活化之前用mest(100mm mes，ph 5.0，0.05％ tween 20)溶液重悬，获取磁珠混悬液；所述磁珠与所述mest溶液的质量体积比为1:(2-6)；
9、所述磁珠混悬液与所述混合液的体积比为1:(2-6)，所述混合液中1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(edc)和n-羟基丁二酰亚胺(nhs)的体积比为1:1。
10、优选的是，所述磁珠的用量为10-100μg；更优选的是最佳用量为25μg。
11、优选的是，所述猪δ冠状病毒n蛋白的包被浓度为0.1-20μg/ml；更优选的是最佳包被浓度为5μg/ml。
12、优选的是，所述封闭液为脱脂奶粉，所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为2.5％-5％。更优选的是所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为5％。
13、本发明还提供所述的免疫磁珠检测试剂盒在非诊断目的的检测猪δ冠状病毒中的应用。
14、优选的是，所述免疫磁珠检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
15、将待测样本进行倍比稀释后，与免疫磁珠共同孵育；之后洗涤；
16、加入稀释hrp标记的山羊抗猪多克隆抗体，孵育；之后洗涤；
17、加入显色液，避光孵育完成后，加入终止液终止反应，测定所述待测样本的od450nm值，以判断所述待测样本中是否含有猪δ冠状病毒igg抗体。
18、优选的是，所述待测样本与所述免疫磁珠在37℃共同孵育反应30min；
19、加入稀释的所述hrp标记的山羊抗猪多克隆抗体后，在37℃继续孵育反应30min；所述hrp标记的羊抗猪多克隆抗体的稀释度为1:8000；
20、加入所述显色液后，37℃避光孵育10min。
21、优选的是，所述判断的标准为：当od450nm≥0.5277时，判定所述待测样本为阳性，即所述待测样本含有猪δ冠状病毒igg抗体；当od450nm＜0.5277时，判断为阴性，即所述待测样本不含猪δ冠状病毒igg抗体。
22、本发明试剂盒的检测原理：以表面修饰的羧基磁性微球为载体，利用edc/nhs将磁珠活化直接与pdcov-n蛋白进行偶联，然后封闭未结合的位点，制备免疫磁珠。将待检血清与免疫磁珠共同孵育，免疫磁珠将pdcov-n特异性igg抗体从反应液中精准捕获，hrp标记的山羊抗猪多克隆抗体作为检测抗体与免疫磁珠上pdcov-n蛋白的特异性抗体结合，于免疫磁珠上形成“pdcov-n蛋白-pdcov-n特异性igg抗体-酶标记抗体”三聚体复合物，再加入tmb底物液后发生显色反应，通过颜色变化和吸光度值的测定可直接判定结果。
23、本发明公开了以下技术效果：
24、本发明基于免疫磁珠检测技术构建的试剂盒，能够在保证高灵敏度和强特异性的条件下将整体反应时间严格控制在1.5-2h内，极大的缩短了操作时间，提高了检测效率。本发明通过优化试剂盒中不同试剂的参数条件，最终得到最优的检测条件：最佳磁珠用量为25μg，最佳包被抗原的浓度为5μg/ml，最佳封闭液为5％脱脂奶粉，封闭时间为2h，最佳酶标抗体(1mg/ml)的稀释度为1/8000，最佳显色时间为10min。在此最优条件下检测猪δ冠状病毒igg抗体结果显示，当od450nm≥0.5277时判定此血清样本为阳性，反之od450nm﹤0.5277则为阴性。可见，本发明通过颜色变化和吸光度值的测定可直接判定结果，方便易操作、高效且成本低，灵敏度为92％，特异度为100％。
1.一种快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括免疫磁珠，所述免疫磁珠为磁珠与猪δ冠状病毒n蛋白偶联制得；
2.如权利要求1所述的快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述免疫磁珠的制备方法包括以下步骤：
3.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠进行活化之前用mest溶液重悬，获取磁珠混悬液；所述磁珠与所述mest溶液的质量体积比为1:(2-6)；
4.如权利要求3所述的快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述磁珠的用量为10-100μg。
5.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述猪δ冠状病毒n蛋白包被浓度为0.1-20μg/ml。
6.如权利要求2所述的快速检测猪δ冠状病毒igg抗体的免疫磁珠检测试剂盒，其特征在于，所述封闭液为脱脂奶粉，所述封闭液中脱脂奶粉的质量百分比为2.5％-5％。
7.如权利要求1-6任一项所述的免疫磁珠检测试剂盒在非诊断目的的检测猪δ冠状病毒中的应用。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述免疫磁珠检测试剂盒的使用方法包括以下步骤：
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述待测样本与所述免疫磁珠在37℃共同孵育反应30min；
10.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述判断的标准为：当od450nm≥0.5277时，判定所述待测样本为阳性，即所述待测样本含有猪δ冠状病毒igg抗体；当od450nm＜0.5277时，判断为阴性，即所述待测样本不含猪δ冠状病毒igg抗体。
