本发明属于生物，具体涉及一种高效提取子宫腺肌病异位病中子宫内膜间充质干细胞的方法及其应用。
背景技术：
1、子宫腺肌病（adenomyosis，am）是育龄期女性常见病、高发病，由其引起的月经过多、痛经以及不孕等严重影响患者身心健康。当前，除子宫切除术外，保守性治疗方案效果总体仍不令人满意。am发病机制学说众多，主要包括“子宫内膜基底部内陷及组织损伤修复学说”及“苗勒管遗迹化生及成体干细胞分化学说”。其中，成体干细胞分化学说认为子宫腺肌病起源于子宫肌层内的胚胎多能干细胞化生，包括苗勒管遗迹化生、来自经血逆流时种植在子宫肌层的子宫内膜上皮祖细胞和子宫内膜间质祖细胞分化。近些年来，随着单细胞测序技术的兴起和应用，多个研究证实多潜能干细胞（multipotential stem cells）在异位病灶的形成、疼痛的加剧及纤维化的形成中均扮演重要角色。其中，susd2表达阳性子宫内膜间充质干细胞（endometrial mesenchymal stem cells，emscs）作为异位病灶中最重要的一种多潜能干细胞，在本领域内尤为受到广泛关注和高度重视。有证据表明异位病灶中子宫内膜间充质干细胞较正常内膜中子宫内膜间充质干细胞有着更强的迁移/侵袭、抗凋亡能力及分化潜能等，且这些增强的细胞生物学特性可以被小分子抑制剂阻断。因此，围绕异位病灶来源子宫内膜间充质干细胞开展相关研究将是子宫腺肌病发病机制研究和个体靶向治疗研究的重要路径之一。
2、显而易见的是，围绕异位病灶子宫内膜间充质干细胞开展相关基础或应用研究的重要前提是能够相对容易的获得异位子宫内膜间充质干细胞，通过检索文献可知从宫腔子宫内膜中分离干细胞方法相对成熟可靠，但是从子宫腺肌病肌层异位病灶中获取异位子宫内膜间充质干细胞的分离方案报道较少。已有的关于异位子宫内膜间充质干细胞的原代分离方法单一，主要为酶消化法，但是该方法存在培养成功率低、原代细胞纯度低及分离周期长等明显缺点。究其原因主要是组织块经酶消化彻底解离后引起异位病灶组织中细胞周围局部微环境急剧改变，使得病灶中含量极低的子宫内膜间充质干细胞活性和贴壁（附着）能力大大降低，从而显著降低异位病灶子宫内膜间充质干细胞的分离及培养效率。组织块法作为经典的原代组织细胞分离代表技术之一，非常适用于松软组织（如皮肤、脂肪及脐带等）且目的细胞含量较为丰富的原代细胞培养，该技术具有操作简单、对细胞活力影响小及分离成本低等优点。然而，子宫腺肌病异位病灶组织因质地坚硬、术后取材时不易准确被识别及子宫内膜间充质干细胞含量极低等特点，至今尚未见有采用单纯组织块法成功培养异位子宫内膜间充质干细胞的研究报道。综上所述，传统的子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞分离方法效率低下、成功率低，严重限制子宫腺肌病研究领域中关于异位子宫内膜间充质干细胞研究方向的发展。因此，拓展更为有效的异位病灶子宫内膜间充质干细胞提取方法是本领域亟待解决的技术问题。
3、经检索文献发现，马艳鸽等人曾在《中国妇幼保健杂志》2015年第30卷报道的题为《子宫内膜异位症和子宫腺肌病在位、异位内膜间质细胞原代培养与形态学观察》文章中指出，若在37℃ 恒温水浴箱中采用混合酶液（0.5 mg/ml iv 型胶原酶与0. 125%胰蛋白酶）消化解离子宫腺肌瘤组织3-5小时，可以成功分离异位子宫内膜间质细胞（endometrialstroma cells， escs），分离、培养该细胞成功率为86.7%。然而该研究仍是通过单独酶消化法彻底解离组织从而释放组织内细胞，目的是为了纯化子宫内膜间质细胞而不是子宫内膜间充质干细胞。由于子宫内膜间充质干细胞在异位病灶组织中含量极低，单独酶消化3-5小时将大大损伤含量较低细胞类型（包括子宫内膜间充质干细胞等）的细胞活性，最终将严重降低异位病灶中子宫内膜间充质干细胞分离、培养效率。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供了一种高效获得子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞及其在基础研究和转化医学中应用的方法。该方法能够在较低成本的条件下，快速、高效分离出数量大、质量高的子宫腺肌病异位病灶来源的子宫内膜间充质干细胞，并将其应用于子宫腺肌病发病机制相关的基础研究和个体化靶向治疗的应用研究。
2、本发明的目的通过以下技术方案实现：
3、一种高效提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法是采用酶消化与组织块相结合的方法进行子宫内膜间充质干细胞提取。
4、其中，所述酶消化法是：采用特殊的复合酶消化液将组织放置在恒温培养箱内置的旋转混匀器上，采用低速、360度旋转的方式进行消化解离。
5、1）上述酶消化法中，所述的复合酶消化液由终浓度为1~1.5 mg/ml胰蛋白酶、和0.25~0.75 mg/ml ⅳ型胶原酶及0.5~1.5 u/μl脱氧核糖核酸酶组成。作为优选的，终浓度为1.25 mg/ml胰蛋白酶和0.5 mg/ml ⅳ型胶原酶组成。
6、2）上述酶消化法中，所述的复合酶消化液消化时间应控制在15至45分钟之间，作为优选，复合酶消化时间为30分钟。
7、3）上述酶消化法中，所述的采用低速360旋转消化解离，旋转速度应控制在0-20rpm，作为优选，旋转速度设定为10 rpm。
8、其中，所述组织块法是：在前述酶消化法结束后开展组织块法处理。首先，离心消化后的组织悬液，弃上清并保留组织沉淀。然后，加入少量胎牛血清重悬组织沉淀并使用无菌吸头分散涂布在培养皿内，转移至培养箱内开始倒置培养。最后，当倒置培养的组织块附着牢靠后再翻转细胞培养皿，同时添加少量完全培养基进行正置培养直至细胞爬出。
9、1）上述组织块法中，所述的组织块法需要在酶消化法结束之后开展，酶消化结束后距开展组织块法处理时间应控制在15分钟以内，作为优选的，在酶消化法结束之后应立即离开展组织块法处理，越快越好。
10、2）所述加入少量血清重悬组织并使用无菌吸头均匀分散涂布在10 cm培养皿内，随后转移至培养箱内的静置时间应控制在1至5分钟之间，作为优选，静置时间应为3分钟。
11、3）所述翻转培养皿开始倒置培养，倒置培养时间应控制在1小时至3小时之间。作为优选，倒置培养时间为2小时。
12、4）所述添加少量完全培养基进行正置培养直至细胞爬出，添加完全培养基的体积应为2至6 ml，作为优选，添加完全培养基的体积为4 ml。
13、本发明的有益效果：本发明专利适于从子宫腺肌病异位病灶中提取子宫内膜间充质干细胞，该方法是根据子宫腺肌病异位病灶病理特点，巧妙的将酶消化和组织块法有机结合，具有分离成功率高、花费时间少、纯度高、增殖活性好及维持体外长期培养时分化潜能等显著优点。本发明方法获得的异位子宫内膜间充质干细胞可用于发病机制相关的基础研究和个体化靶向治疗的应用研究，为推进子宫腺肌病基础和临床研究注入新动力。与背景技术中的论文相比，本发明采取了与以往完全不同的策略，即首先采用复合酶消化液低速、360旋转的方式短时（30分钟）消化解离异位病灶组织，这样做的目的是消化病灶组织表层的细胞外基质及结缔纤维，帮助疏通“迁徙通道”有利于后续组织块贴壁培养时内膜细胞爬出。同时尽可能减少对组织中含量极低的子宫内膜间充质干细胞活性损伤。紧接着，本发明进一步使用组织贴壁法，将初步消化解离的组织先行倒置贴壁培养，等倒置培养的组织块附着牢靠后再行正置培养直至原代子宫内膜细胞爬出并汇合。最后，使用pe标记的susd2抗体按常规磁珠分选法分离子宫内膜间充质干细胞。
1.一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法是采用酶消化法与组织块法相结合的方法进行子宫腺肌病异位病灶中原代子宫内膜细胞提取，随后使用pe标记的susd2抗体按常规磁珠分选法分离子宫内膜间充质干细胞，所述酶消化法是：将复合酶消化液加入盛放组织的容器，将其放置在恒温培养箱内置的旋转混匀器上进行消化解离；所述的组织块法是：在所述酶消化法结束后离心弃上清并保留组织沉淀，加入少量血清重悬组织并使用无菌吸头分散涂布在培养皿内，将培养皿转移至培养箱内开始倒置培养，当倒置培养的组织块附着牢靠后再翻转细胞培养皿，同时添加完全培养基进行正置培养，直至组织块周围内膜细胞爬出并生长至完全汇合；最后，使用pe标记的susd2抗体按常规磁珠分选法分离子宫内膜间充质干细胞。
2. 根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于所述的复合酶消化液由终浓度为1~1.5 mg/ml胰蛋白酶和0.25~0.75 mg/ml ⅳ型胶原酶组成。
3. 根据权利要求2所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的特殊复合酶消化液由终浓度为1.25 mg/ml胰蛋白酶和0.5 mg/mlⅳ型胶原酶组成。
4.根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的复合酶消化液消化时间控制在15至45分钟之间，优选30分钟。
5. 根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，酶消化法中将容器放置在恒温培养箱内置的旋转混匀器上，采用低速360旋转消化解离；所述的低速为低于20 rpm的旋转速度；优选10 rpm的旋转速度。
6.根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述的组织块法需要在酶消化法结束之后15分钟内开展，优选在酶消化法结束之后立即开展。
7. 根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，所述加入少量血清重悬组织并使用无菌吸头均匀分散涂布在10 cm培养皿内，随后转移至培养箱内的静置时间控制在1至5分钟之间，优选控制在3分钟。
8.根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，将培养皿转移至培养箱开始倒置培养。其中，倒置培养时间控制在1至3小时之间，优选倒置培养时间为2小时。
9. 根据权利要求1所述的一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法，其特征在于，当倒置培养的组织块附着牢靠后再翻转10 cm细胞培养皿进行正置培养，同时添加完全培养基直至组织块周围内膜细胞爬出并生长至完全汇合，所述的添加完全培养基的体积为2至6 ml。
10.根据权利要求1—9所述的任意一种提取子宫腺肌病异位病灶中子宫内膜间充质干细胞的方法在基础研究和靶向治疗中的应用。
