本发明涉及生物，特别涉及一种酿酒酵母制备d-阿洛酮糖的方法。
背景技术：
1、作为稀有糖的一种，d-阿洛酮糖(d-psicose)与d-果糖互为同分异构体，口感与蔗糖相近，但其热量接近于0，几乎不在人体内代谢，不会给人体带来额外的消化负担。同时可与食物中的蛋白质、氨基酸发生美拉德反应，用于食物色泽的改善。此外，d-阿洛酮糖还具备保护神经、抑制血糖升高、降血脂、抗氧化等功能特性。因此，其在食品、医疗、保健方面具有广泛的应用前景。
2、伴随生活水平的日益提升，日常饮食中糖摄入量与其产热量越来越受到人们的重视，但由于d-阿洛酮糖在自然界中含量极少，且提取成本高，仅从天然产物角度出发，难以满足快速增长的市场需求，因此目前主要以化学合成和生物转化来制备d-阿洛酮糖。化学合成法包括利用钼酸离子的催化作用将d-果糖转化合成d-阿洛酮糖，对1,2,4,5-二-o-异亚丙基-β-d-吡喃果糖进行三步骤化学处理过程生产阿洛酮糖等方式，但因存在工艺复杂、环境污、染产量低和副产物多等问题，难以实现工业化的大规模生产。因此，以生物转化的方式制备d-阿洛酮糖以其反应条件温和、转化效率高、绿色环保等优点逐渐成为当今开发研究的重点方向。
3、现阶段，生物转化法主要是在d-阿洛酮糖3-差向异构酶(简称为dpease)的催化作用下，单一催化d-果糖合成d-阿洛酮糖，该方法催化合成效率较高，是合成d-阿洛酮糖的主要方式。不同微生物来源的dpease作用于不同的异源宿主中所表现出的催化效果会呈现出一定差异性，大肠杆菌以其操作系统成熟、培养简单且细胞生长迅速等特点而成为dpease异源表达宿主的主要研究对象，但大肠杆菌自身会产生内毒素，使其在工业生产尤其食品领域大大受限。枯草芽孢杆菌和酿酒酵母作为常用的表达体系，均不含内毒素，菌体生长迅速，操作系统也十分成熟，因此更适用于工业应用。以枯草芽孢杆菌作为宿主生产d-阿洛酮糖会导致残余的果糖无法转化，残余菌体无法被有效利用。
4、酿酒酵母作为研究真核生物的模式生物，具有生长周期短、发酵能力强、易进行大规模培养等优势，在食品、医药等领域应用广泛。以酿酒酵母作为宿主制备d-阿洛酮糖，利用酿酒酵母本身的生长特性，可以将残余的果糖转化为乙醇和生物量，从而解决d-果糖和d-阿洛酮糖的分离问题，并且完成转化后的酵母菌体可作为优质蛋白进行回收利用，从而节约生产成本。以酵母作为异源宿主表达dpease制备d-阿洛酮糖的转化率可观，但存在转化时间较长，转化效率较低等问题，且在生物反应器体系中以酿酒酵母制备d-阿洛酮糖的工艺参数研究鲜有涉及。
5、现有技术公开了一种马克斯克鲁维酵母(kluyveromyces marxianus)工程菌株，该菌株能够异源表达agrobacterium tumefaciens的dpe，利用该工程菌株作为生物催化剂，以750g/l的d-果糖为底物，55℃反应12h得到190g/l的d-阿洛酮糖，转化率达25.3％(cell regeneration and cyclic catalysis of engineered kluyveromyces marxianusof a d-psicose-3-epimerase gene from agrobacterium tumefaciens for d-alluloseproduction)。
6、现有技术还公开了一种表达d-阿洛酮糖-3-差向异构酶的重组枯草芽孢杆菌，其以枯草芽孢杆菌作为底盘细胞，pma5为表达载体构建重组工程菌株，实现dpease的表达，重组菌株b.subtilis 168/pma5-spovg-ds-srfa-rc在750g/l的d-果糖为底物，30分钟内可产生244.3g/l的d-阿洛酮糖，转化率为32.6％(cn112695006a)。
7、现有技术还公开了一种转化率达到26.6％的重组酿酒酵母菌株，其中反应时间需要12h(bioprocessing and technoeconomic feasibility analysis of simultaneousproduction of d-psicose and ethanol using engineered yeast strain kam-2gd)。
8、现有技术包括利用固定化酶催化技术生产d-阿洛酮糖和利用全细胞催化生产d-阿洛酮糖，其中，利用固定化酶催化技术需要提取、分离与纯化酶，步骤较为繁琐，且生产成本较高。利用全细胞催化生产d-阿洛酮糖需考虑不同的异源表达宿主，目前常用的宿主有：大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酵母。大肠杆菌自身会产生内毒素，难以应用于食品类工业生产，枯草芽孢杆菌无法转化残余的果糖，导致后续d-阿洛酮糖分离繁琐、困难，且增加了生产成本。以酿酒酵母作为异源表达宿主可以规避以上一系列问题，根据专利cn116555306a的内容，可以将酿酒酵母转化d-阿洛酮糖的能力提升至较为可观的水平，但仍存在转化时间较长，转化效率较低等问题。
技术实现思路
1、有鉴于此，本发明旨在构建并优化一套以酿酒酵母为宿主制备d-阿洛酮糖的体系过程，提供表达模块及组合、重组载体、重组菌株、制备d-阿洛酮糖的方法，实现在2l生物反应器以及15l生物反应器水平利用d-果糖对d-阿洛酮糖的高效转化。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了表达模块组合，包括表达模块1和表达模块2；
4、所述表达模块1包括can基因的上游同源臂、can基因的下游同源臂、dpease表达盒和潮霉素表达盒；
5、所述表达模块2包括ho基因的上游同源臂、ho基因的下游同源臂、groel表达盒和ura3表达盒。
6、在本发明的一些具体实施方案中，上述表达模块组合包括：
7、所述表达模块1具有：
8、(1)、如seq id no:1所示的核苷酸序列；或
9、(2)、如(1)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(1)的相同或相似；或
10、(3)、与如(1)或(2)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
11、所述表达模块2具有：
12、(4)、如seq id no:2所示的核苷酸序列；或
13、(5)、如(4)所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或多个碱基获得的核苷酸序列，且功能与(4)的相同或相似；或
14、(6)、与如(4)或(5)所示的核苷酸序列至少有90％同源性的核苷酸序列；
15、所述多个为2个至500个。
16、本发明还提供了重组载体，包括上述表达模块组合。
17、本发明还提供了重组菌株，包括上述表达模块组合或上述重组载体。
18、本发明还提供了重组酿酒酵母378604x，通过在can基因中插入dpease表达盒和潮霉素表达盒，在ho基因中插入groel表达盒和ura3表达盒获得。
19、在本发明的一些具体实施方案中，上述重组酿酒酵母378604x的构建方法包括：将上述表达模块组合转入酿酒酵母378604x获得。
20、本发明还提供了d-阿洛酮糖的制备方法，基于如下任一项制备：
21、(i)、上述表达模块组合；
22、(ii)、上述重组载体；
23、(iii)、上述重组菌株；
24、(iv)、上述重组酿酒酵母378604x。
25、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法包括如下步骤：
26、步骤(1)：取上述重组酿酒酵母378604x接入一级种子培养基，培养，获得一级种子液；
27、步骤(2)：取所述一级种子液和二级种子培养基混合，培养，获得二级种子液；
28、步骤(3)：取葡萄糖母液、ypd培养基和所述二级种子液混合，在
29、(i)通气、
30、(ii)温度为27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃或33℃、
31、(iii)溶氧为27％、28％、29％、30％、31％、32％或33％
32、的条件下发酵20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h后，调整温度至52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃或58℃，补入d-果糖和氯化钴，使所述d-果糖终浓度为180g/l、185g/l、190g/l、195g/l、200g/l、205g/l、210g/l、215g/l或220g/l、所述氯化钴终浓度为0.9mm、0.95mm、0.98mm、1.0mm、1.02mm、1.05mm或1.1mm，继续发酵100min、105min、110min、115min、120min、125min或130min，补入d-果糖，使所述d-果糖终浓度为80g/l、85g/l、90g/l、95g/l、100g/l、105g/l、110g/l、115g/l或120g/l，继续发酵，获得d-阿洛酮糖。
33、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法包括如下步骤：
34、步骤(1)：取上述重组酿酒酵母378604x接入一级种子培养基，培养，获得一级种子液；
35、步骤(2)：取所述一级种子液和二级种子培养基混合，培养，获得二级种子液；
36、步骤(3)：取葡萄糖母液、ypd培养基和所述二级种子液混合，在
37、(i)通气、
38、(ii)温度为27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃或33℃、
39、(iii)溶氧为27％、28％、29％、30％、31％、32％或33％
40、的条件下发酵20h、21h、22h、23h、24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h后，分离出菌体，与d-果糖、硫酸钴和生理盐水混合，使所述d-果糖终浓度为180g/l、185g/l、190g/l、195g/l、200g/l、205g/l、210g/l、215g/l或220g/l、所述硫酸钴终浓度为0.9mm、0.95mm、0.98mm、1.0mm、1.02mm、1.05mm或1.1mm，调整温度至52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃或58℃，继续发酵120min、125min、130min、135min、140min、145min、150min、155min、160min、170min、180min、210min、240min或300min，获得d-阿洛酮糖。
41、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中：
42、所述一级种子培养基包括sc-ura+hyg液体培养基；和/或
43、所述二级种子培养基包括sc-ura+hyg液体培养基。
44、在本发明的一些具体实施方案中，上述制备方法中：
45、所述一级种子培养基的体积包括5ml；和/或
46、所述二级种子培养基的体积包括50ml；和/或
47、所述葡萄糖母液的浓度包括600g/l；和/或
48、所述葡萄糖母液、所述ypd培养基和所述二级种子液的混合体积比包括33:100:867。
49、在本发明的一些具体实施方案中，d-阿洛酮糖的制备方法包括如下步骤：
50、将上述重组酿酒酵母378604x单菌落接入5ml sc-ura+hyg液体培养基，30℃、250rpm过夜培养，待菌体长至生长对数期(od为9～11)，转接至50ml sc-ura+hyg液体培养基，调整od至0.2，30℃、250rpm培养12h，获得二级种子液；
51、取33ml灭菌的600g/l葡萄糖母液、867ml的灭菌的ypd培养基和100ml所述二级种子液混合，在30℃、ph值5.5、通气流速1vvm、溶氧30％的条件下发酵24h；
52、调整发酵条件为55℃、不控制溶氧，补入d-果糖和氯化钴，使所述d-果糖的终浓度为200g/l和所述氯化钴的终浓度为1mm，发酵120min，补入d-果糖，使所述d-果糖的终浓度为100g/l，发酵，获得d-阿洛酮糖。
53、本发明的酿酒酵母制备d-阿洛酮糖的方法有如下效果：
54、本发明实现在2l生物反应器水平下，利用酿酒酵母菌种制备d-阿洛酮糖，发酵菌种没有毒性，且酿酒酵母能够将残余的d-果糖转化为乙醇和生物量，残余的菌体可以进行回收再利用，能够满足食品工业生产需求。在此基础上，采用原位发酵、转化d-果糖为d-阿洛酮糖的策略，从而简化发酵操作，规避不必要的步骤，减少生产成本。
55、具体而言，通过建立一套在2l生物反应器水平的发酵参数，尤其将补入果糖浓度设置为先一次性加200g/l，再在2h一次性加100g/l，从而实现在2l生物反应器中高效制备d-阿洛酮糖，使转化效率可达到20.82g/l/h，要高于目前文献所报道的酵母菌类的15.83g/l/h，高于目前专利中所报道的酿酒酵母的6.864g/l/h。
56、同时本发明还提供了出水洗后发酵、利用水洗操作循环使用菌体以及所表达酶的操作。
1.表达模块组合，其特征在于，包括表达模块1和表达模块2；
2.如权利要求1所述的表达模块组合，其特征在于，包括：
3.重组载体，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的表达模块组合。
4.重组菌株，其特征在于，包括如权利要求1或2所述的表达模块组合或如权利要求3所述的重组载体。
5.重组酿酒酵母378604x，其特征在于，在can基因中插入dpease表达盒和潮霉素表达盒，在ho基因中插入groel表达盒和ura3表达盒。
6.如权利要求5所述的重组酿酒酵母378604x，其特征在于，其构建方法包括：将如权利要求2所述的表达模块组合转入酿酒酵母378604x获得。
7.d-阿洛酮糖的制备方法，其特征在于，基于如下任一项制备：
8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
9.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
10.如权利要求8或9所述的制备方法，其特征在于，包括：
