本发明涉及生物，尤其是涉及一种用于hla-i和hpa多重pcr的引物组合物、应用和基因分型方法。
背景技术：
1、血小板具有粘附、释放、聚集等多种功能，在止血、凝血过程中起重要的作用。血小板输注可作为血小板减少症、出血性疾病以及恶性肿瘤放化疗、白血病、造血干细胞移植的支持手段。多次输注血小板后易产生血小板抗体而引起输注无效。导致血小板输注无效的因素包括免疫性因素和非免疫性因素。非免疫性因素包括发热、感染、dic(disseminatedintravascular coagulation，弥散性血管内凝血)和脾肿大等。
2、免疫性ptr(platelet transfusion refractoriness，血小板输注无效)主要与hla-i类抗体和hpa抗体有关。血小板表面存在着大量抗原，通常分为两类：一类是与其他血细胞或组织共有的抗原，称血小板相关抗原，如hla-i类抗原、abo抗原系统等；另一类是血小板特异性抗原，表现出血小板独特的遗传多态性，即人类血小板抗原(human plateletantigen，hpa)，是位于血小板膜糖蛋白(glycoprotein，gp)上的抗原表位。而目前血小板输注仅考虑abo同型输注，这样多次反复输注血小板会产生同种免疫抗体，进而引起血小板输注无效。
3、目前解决免疫性ptr最常见的办法是进行随机血小板血清学交叉配型，选择血清学配型相合的血小板进行输注；另一种方法就是血小板基因配型，即选择与患者hla-i类和/或hpa基因型相配合的献血者血小板进行输注，这种方法需要建立已知hla-i类、hpa基因分型数据的血小板供者基因数据库，选择hla-i类、hpa基因配合性的献血者血小板进行输注，解决免疫性血小板输注无效的问题。
4、要建立已知hla和hpa基因分型数据的血小板供者库就需要建立准确、方便、高通量的hla和hpa基因分型技术。目前检测hla和hpa的方法主要有pcr-ssp、pcr-sso、pcr-sbt和新一代测序(ngs)等，这些方法中pcr-ssp和pcr-sso的方法虽然简单快速，但是存在准确性不高的问题；pcr-sbt的方法虽然准确性高，但是检测过程工作量偏大，时间较长，此外上述几种方法只能单独检测hla-i类和hpa基因，未能实现同步检测；而最新的基于捕获方法的ngs技术虽然可以实现hla和hpa的同步高通量检测，但是由于需要设计合成诸多探针，其检测成本偏高，故现有方法均不利于快速建设血小板供者基因数据库，需要寻找新的检测策略和方法。
5、有鉴于此，特提出本发明。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种用于hla-i和hpa多重pcr的引物组合物，以改进hla和hpa基因分型方法，基于该引物组合物，本发明的目的还在于提供其应用和hla-i和hpa基因分型的方法。
2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：
3、第一方面，提供了一种用于hla-i和hpa多重pcr的引物组合物，其包含：
4、hla-a引物对：包含核苷酸序列如seq id no.1所示的引物hla-af，和核苷酸序列如seq id no.2所示的引物hla-ar；
5、hla-b引物对，包含核苷酸序列如seq id no.3所示的引物hla-bf，和核苷酸序列如seq id no.4所示的引物hla-br；
6、hla-c引物对，包含核苷酸序列如seq id no.5所示的引物hla-cf，和核苷酸序列如seq id no.6所示的引物hla-cr；
7、hpa-1,4引物对，包含核苷酸序列如seq id no.7所示的引物hpa-1,4f，和核苷酸序列如seq id no.8所示的引物hpa-1,4r；
8、hpa-2引物对，包含核苷酸序列如seq id no.9所示的引物hpa-2f，和核苷酸序列如seq id no.10所示的引物hpa-2r；
9、hpa-3引物对，包含核苷酸序列如seq id no.11所示的引物hpa-3f，和核苷酸序列如seq id no.12所示的引物hpa-3r；
10、hpa-5引物对，包含核苷酸序列如seq id no.13所示的引物hpa-5f，和核苷酸序列如seq id no.14所示的引物hpa-5r；
11、hpa-6w引物对，包含核苷酸序列如seq id no.15所示的引物hpa-6wf，和核苷酸序列如seq id no.16所示的引物hpa-6wr；
12、hpa-15引物对，包含核苷酸序列如seq id no.17所示的引物hpa-15f，和核苷酸序列如seq id no.18所示的引物hpa-15r；
13、hpa-21w引物对，包含核苷酸序列如seq id no.19所示的引物hpa-21wf，和核苷酸序列如seq id no.20所示的引物hpa-21wr。
14、第二方面，提供了第一方面的引物组合物在如下(ⅰ)～(ⅴ)任意一项中的应用：
15、(ⅰ)扩增hla-i和hpa基因或制备用于扩增hla-i和hpa基因的试剂盒；
16、(ⅱ)构建hla-i和hpa基因测序文库或制备用于构建hla-i和hpa基因测序文库的试剂盒；
17、(ⅲ)用于hla-i和hpa基因测序或制备hla-i和hpa基因测序试剂盒；
18、(ⅳ)用于hla-i和hpa基因分型或制备hla-i和hpa基因分型试剂盒；
19、(ⅴ)制备血小板基因配型试剂盒。
20、第三方面，提供了一种用于hla-i和hpa扩增的试剂盒，该试剂盒包含第一方面的引物组合物。
21、第四方面，提供了一种hla-i和hpa基因分型的方法，包括使用第一方面的引物组合物扩增待测样本中的hla-i和hpa基因；将扩增产物构建为测序文库，然后测序并对测序数据进行生物信息学分析，获得待测样本中hla-i和hpa的基因型；
22、所述扩增为多重pcr扩增；
23、hla-i类抗原包括hla-a、hla-b和hla-c；hpa抗原包括hpa-1、hpa-2、hpa-3、hpa-4、hpa-5、hpa-6w、hpa-15和hpa-21w。
24、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
25、本发明通过设计特异性引物，实现了在同一体系下的同时扩增hla-i类和hpa-1、hpa-2、hpa-3、hpa-4、hpa-5、hpa-6w、hpa-15和hpa-21w基因，可有效降低检测成本，节约检测实验时间，从而满足患者的应急需求。且经验证，使用本发明提供的引物组合物到的扩增产物测序后，hla-i和hpa分型与已知分型的样本符合率为100％。
26、本发明提供的hla-i和hpa基因分型的方法，在多重pcr方法的基础上结合测序技术，具有高通量、快速、准确，以及同步检测hla-i类和hpa基因的特点。该方法将有利于提高血小板供者基因库hla和hpa基因检测效率，可以应用于血小板供者基因数据库建设，以便扩展血小板供者基因数据库规模和基因配合工作，提高血小板输注的安全性及有效性，节约血小板资源，提升血液安全。
1.用于hla-i和hpa多重pcr的引物组合物，其特征在于，包含：
2.根据权利要求1所述的引物组合物，其特征在于，各引物的工作浓度为：
3.根据权利要求2所述的引物组合物，其特征在于，各引物的工作浓度为：
4.权利要求1～3任一项所述的引物组合物在如下(ⅰ)～(ⅴ)任意一项中的应用：
5.用于hla-i和hpa扩增的试剂盒，其特征在于，包含权利要求1～3任一项所述的引物组合物。
6.hla-i和hpa基因分型的方法，其特征在于，包括使用权利要求1～3任一项所述的引物组合物扩增待测样本中的hla-i和hpa基因；将扩增产物构建为测序文库，然后测序并对测序数据进行生物信息学分析，获得待测样本中hla-i和hpa的基因型；
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，以基因组dna作为扩增模板；
8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，采用转座子酶的方法进行文库制备。
9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用二代测序获得测序数据；
10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，使用软件typestream visual software进行hla-a、hla-b和hla-c分型；使用软件clc main workbench进行hpa-1、hpa-2、hpa-3、hpa-4、hpa-5、hpa-6w、hpa-15和hpa-21w分型。
