本公开涉及用于改变靶核酸序列或调节靶核酸序列的表达的基因组编辑系统和方法，以及其与编码血红蛋白亚基的基因的改变和/或血红蛋白病的治疗相关的应用。
背景技术：
1、血红蛋白(hb)将红血球或红细胞(rbc)中的氧气从肺部携带到组织。在产前发育期间直至出生后不久，血红蛋白以胎儿血红蛋白(hbf)，一种由两条alpha(α)-珠蛋白链和两条gamma(γ)-珠蛋白链组成的四聚体蛋白，的形式存在。hbf大部分被成人血红蛋白(hba)，一种四聚体蛋白，替代，其中hbf的γ-珠蛋白链通过称为珠蛋白转换的过程被beta(β)-珠蛋白链替代。成人平均产生的hbf占总血红蛋白的不到1％(thein 2009)。α-血红蛋白基因位于16号染色体上，而β-血红蛋白基因(hbb)、a gamma(aγ)-珠蛋白链(hbg1，也称为γ珠蛋白a)和g gamma(gγ)-珠蛋白链(hbg2，也称为γ珠蛋白g)位于珠蛋白基因簇内的11号染色体上(也称为珠蛋白基因座)。
2、hbb突变可能导致血红蛋白病症(即，血红蛋白病)，所述血红蛋白病症包含镰状细胞病(scd)和β-地中海贫血(β-thal)。美国大约有93,000人被诊断患有血红蛋白病。全球每年有300,000名儿童出生时患有血红蛋白病(angastiniotis 1998)。由于这些病状与hbb突变相关，因此它们的症状通常直到珠蛋白从hbf转换为hba后才会显现。
3、scd是美国最常见的遗传性血液疾病，影响大约80,000人(brousseau 2010)。scd在非洲血统的人中最为常见，scd的患病率为500中1个。在非洲，scd患病率为1500万(aliyu2008)。scd在印度、沙特阿拉伯和地中海血统的人中也更常见。在西班牙裔美国人中，镰状细胞病的患病率为1,000中1个(lewis 2014)。
4、scd是由hbb基因中的单个纯合突变引起的，c.17a>t(hbs突变)。镰状突变是hbb上的点突变(gag>gtg)，引起外显子1中氨基酸位置6处的谷氨酸被缬氨酸取代。β-血红蛋白链的位置6处的缬氨酸是疏水性的，并且当它不与氧结合时，会使β-珠蛋白构象发生变化。这种构象的变化使hbs蛋白在缺氧的情况下聚合，导致rbc变形(即，镰状化)。scd以常染色体隐性方式遗传，使得只有具有两个hbs等位基因的患者才会患有所述疾病。杂合子受试者具有镰状细胞特征，并且如果所述受试者严重脱水或缺氧，可能会出现贫血和/或痛苦危象。
5、镰状rbc会引起多种症状，包含贫血、镰状细胞危象、血管闭塞性危象、再生障碍性危象和急性胸部综合征。镰状rbc的弹性低于野生型rbc的弹性，因此不能轻易穿过毛细血管床并引起闭塞和缺血(即，血管闭塞)。当镰状细胞阻碍器官毛细血管床的血流，导致疼痛、缺血和坏死时，就会发生血管闭塞性危象。这些发作通常持续5-7天。脾脏在清除功能失调的rbc方面发挥着作用，因此通常在儿童早期会肿大，并且经常发生血管闭塞性危象。到儿童末期，scd患者的脾脏常常梗塞，这导致自体脾切除术。溶血是scd的一个持续特征，并且会导致贫血。镰状细胞在循环中存活10-20天，而健康rbc存活90-120天。scd受试者根据需要进行输血以维持足够的血红蛋白水平。频繁输血使受试者有感染hiv、乙型肝炎和丙型肝炎的风险。受试者还可能患有急性胸部危象以及四肢、终末器官和中枢神经系统的梗死。
6、scd受试者的预期寿命会缩短。通过对危象和贫血进行仔细的终身管理，scd患者的预后正在稳步改善。截至2001年，镰状细胞病受试者的平均预期寿命为55-59岁。目前scd的治疗涉及危象期间的水合作用和疼痛管理，以及根据需要输血以纠正贫血。
7、地中海贫血(例如β-thal、δ-thal和β/δ-thal)会导致慢性贫血。据估计，β-thal影响全世界100,000个人中的大约1个。β-thal在某些群体中的患病率较高，包含欧洲血统的群体，其中其患病率为10,000中大约1个。重型β-thal，所述疾病的更严重形式，除非用终身输血和螯合疗法治疗，否则会危及生命。在美国，大约有3,000名重型β-thal受试者。β-thal中间体不需要输血，但可能导致生长延迟和显著的全身异常，并且通常需要终生螯合疗法。尽管hba构成成人rbc中的大部分血红蛋白，但大约3％的成人血红蛋白以hba2，一种hba变体，的形式存在，其中两条γ-珠蛋白链被两条delta(δ)-珠蛋白链替代。δ-thal与导致hbd表达缺失的δ血红蛋白基因(hbd)突变相关。hbd突变的共同遗传可以通过将hba2水平降低到正常范围来掩盖β-thal(即，β/δ-thal)的诊断(bouva 2006)。β/δ-thal通常是由两个等位基因中的hbb和hbd序列缺失引起的。在纯合子(δo/δoβo/βo)患者中，hbg被表达，导致仅产生hbf。
8、与scd一样，β-thal是由hbb基因突变引起的。导致β-thal的最常见hbb突变为：c.-136c>g、c.92+1g>a、c.92+6t>c、c.93-21g>a、c.118c>t、c.316-106c>g、c.25_26delaa、c.27_28insg、c.92+5g>c、c.118c>t、c.135delc、c.315+1g>a、c.-78a>g、c.52a>t、c.59a>g、c.92+5g>c、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-78a>g、c.52a>t、c.124_127delttct、c.316-197c>t、c.-138c>t、c.-79a>g、c.92+5g>c、c.75t>a、c.316-2a>g和c.316-2a>c。这些和其它与β-thal相关的突变会导致β-珠蛋白链突变或不存在，从而导致正常hbα-血红蛋白与β-血红蛋白的比率被破坏。过量的α-珠蛋白链沉淀在骨髓中的红系前体中。
9、在重型β-thal中，hbb的两个等位基因都含有导致β-珠蛋白完全不存在(表示为β0/β0)的无义、移码或剪接突变。重型β-thal引起β-珠蛋白链严重减少，导致rbc中α-珠蛋白链显著沉淀和更严重的贫血。
10、β-thal中间体是由hbb的5'或3'非翻译区突变、hbb启动子区域或多腺苷酸化信号突变或hbb基因内剪接突变产生的。患者基因型表示为βo/β+或β+/β+。βo表示β-珠蛋白链的表达不存在；β+表示功能失调但存在的β-珠蛋白链。表型表达因患者而异。由于产生了一些β-珠蛋白，β-thal中间体引起红系前体中α-珠蛋白链的沉淀较少，并且贫血比重型β-thal更轻。然而，继发于慢性贫血的红系谱系扩张具有更显著的后果。
11、重型β-thal受试者的年龄在6个月至2岁之间，并且患有生长迟缓、发烧、肝脾肿大和腹泻。充分的治疗包含定期输血。重型β-thal的疗法还包含脾切除术和用羟基脲治疗。如果患者定期输血，则他们将正常发育直到第二个十年之初为止。那时，所述患者需要螯合疗法(除了持续输血之外)以预防铁过载并发症。铁过载可能表现为生长延迟或性成熟延迟。在成年期，螯合疗法不充分可能导致心肌病、心律失常、肝纤维化和/或肝硬化、糖尿病、甲状腺和甲状旁腺异常、血栓形成和骨质疏松症。频繁输血还会使受试者面临感染hiv、乙型肝炎和丙型肝炎的风险。
12、β-thal中间体受试者的年龄通常在2-6岁之间。他们通常不需要输血。然而，由于红系谱系慢性肥大以代偿慢性贫血，发生骨异常。受试者可能因骨质疏松症而发生长骨骨折。髓外红血球生成是常见的，并且会导致脾脏、肝脏和淋巴结肿大。所述髓外红血球生成还可能导致脊髓压迫和神经系统问题。受试者还患有下肢溃疡并且血栓事件的风险增加，包含中风、肺栓塞和深静脉血栓形成。β-thal中间体的治疗包含脾切除术、补充叶酸、羟基脲疗法以及髓外肿块的放射疗法。螯合疗法用于出现铁过载的受试者。
13、β-thal患者的预期寿命通常会缩短。未接受输血疗法的重型β-thal受试者通常会在二十岁或三十岁时死亡。接受定期输血和充分螯合疗法的重型β-thal受试者可以活到五十岁甚至更久。继发于铁中毒的心力衰竭是重型β-thal受试者因铁中毒而死亡的主要原因。
14、目前正在开发针对scd和β-thal的多种新的治疗。目前正在临床试验中研究通过基因疗法递送抗镰状化hbb基因。然而，这种方法的长期功效和安全性未知。来自hla匹配的同种异体干细胞供体的造血干细胞(hsc)移植已被证明会治愈scd和β-thal，但此程序涉及风险，包含与为受试者移植做准备所必需的消融疗法相关的风险，增加了危及生命的机会性感染的风险以及移植后移植物抗宿主病的风险。另外，匹配的同种异体供体通常无法鉴定。因此，需要管理这些和其它血红蛋白病的改进方法。
技术实现思路
1、在某些方面，提供了一种减轻有需要的受试者的β-地中海贫血(β-thal)的一种或多种症状的方法。在某些实施例中，所述方法包括a)从所述受试者中分离出cd34+或造血干细胞群体；b)通过将rnp复合物递送到分离的细胞群体来离体修饰所述分离的细胞群体，从而改变所述群体中的一个或多个分离的细胞中的hbg基因的启动子，所述rnp复合物包括：cpf1和grna，所述grna包括：5'端和3'端、在所述5'端处的rna和dna延伸部、在所述5'和/或3'端处的修饰，例如硫代磷酸酯键和/或2'-o-甲基修饰，以及靶向结构域，所述靶向结构域与所述hbg基因的所述启动子中的靶位点互补；以及c)向所述受试者施用经修饰的分离的细胞群体，从而减轻所述受试者的β-thal的一种或多种症状。在某些实施例中，修饰可以是在3'端处、在5'端处或在3'和5'端处的2'-o-甲基修饰(例如，2'-o-甲基腺苷)。在某些实施例中，修饰可以是硫代磷酸酯键，随后是在3'端处的2'-o-甲基腺苷。在某些实施例中，dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。在某些实施例中，靶向结构域可以包括表7、8、11或12中所示的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。在某些实施例中，所述cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。在某些实施例中，cpf1包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，所述cpf1包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
2、在某些方面，提供了一种诱导来自β-地中海贫血(β-thal)受试者的cd34+或造血干细胞群体中的血红蛋白(hb)表达的方法。在某些实施例中，所述方法包括将包括向导rna(grna)和cpf1的rnp复合物递送到来自β-thal受试者的未修饰的cd34+或造血干细胞群体，以产生包括indel的经修饰的cd34+或造血干细胞群体，所述grna包括grna靶向结构域，其中每个经修饰的cd34+或造血干细胞包括hbg基因启动子中的indel，并且其中所述经修饰的cd34+或造血干细胞群体包括比所述未修饰的cd34+或造血干细胞群体更高的hb水平。在某些实施例中，所述grna包括dna延伸部，所述dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。在某些实施例中，grna靶向结构域可以包括表7、8、11或12中所示的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，所述grna包括靶向结构域，所述靶向结构域与hbg基因的所述启动子中的靶位点互补，其中所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。在某些实施例中，所述rnp复合物包括cpf1，所述cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。在某些实施例中，cpf1包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，所述cpf1包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
3、本文提供了基因组编辑系统、核糖核蛋白(rnp)复合物、向导rna、包含经修饰的cpf1蛋白(cpf1变体)的cpf1蛋白以及用于改变一个或多个γ-珠蛋白基因(例如hbg1、hbg2或hbg1和hbg2)的启动子区域并增加胎儿血红蛋白(hbf)的表达的crispr介导的方法。在某些实施例中，rnp复合物可以包含与野生型cpf1或经修饰的cpf1 rna向导的核酸酶(经修饰的cpf1蛋白)复合的向导rna(grna)。
4、在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。在某些实施例中，rnp复合物可以包括表10中所示的rnp复合物。例如，rnp复合物可以包含包括seq id no:1051中所示的序列的grna和由seq id no:1097中所示的序列编码的经修饰的cpf1蛋白(rnp32，表10)。
5、在某些实施例中，经修饰的cpf1蛋白可以含有一种或多种修饰。在某些实施例中，所述一种或多种修饰可以包含但不限于野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签(例如his标签)或其组合。在某些实施例中，经修饰的cpf1可以由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097、1107-09(cpf1多肽序列)或seq id no:1019-1021、1110-17(cpf1多核苷酸序列)中所示的序列编码。
6、在某些实施例中，包括经修饰的cpf1蛋白的rnp复合物可以增加靶核酸的编辑。在某些实施例中，包括经修饰的cpf1蛋白的rnp复合物可以增加编辑，从而引起生产性indel增加。在各个实施例中，靶核酸编辑的增加可以通过本领域技术人员已知的任何手段来评估，如但不限于靶核酸的pcr扩增和随后的测序分析(例如，桑格测序(sangersequencing)、下一代测序)。
7、在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、一个或多个或一段脱氧核糖核酸(dna)碱基(本文也称为“dna延伸部”)、一个或多个或一段核糖核酸(rna)碱基(本文也称为“rna延伸部”)或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。例如，在某些实施例中，dna延伸部可以包括seq id no:1235-1250中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。例如，在某些实施例中，rna延伸部可以包括seqid no:1231-1234、1251-1253中所示的序列。在某些实施例中，包括经修饰的grna的rnp复合物可以增加靶核酸的编辑。在某些实施例中，包括经修饰的grna的rnp复合物可以增加编辑，从而引起生产性indel增加。
8、在一个方面，本公开涉及一种rnp复合物，其包括来自普雷沃氏菌属(prevotella)和弗朗西斯氏菌属(franciscella)1的crispr(cpf1)rna向导的核酸酶或其变体以及grna，其中所述grna能够与细胞中hbg基因的启动子中的靶位点结合。在某些实施例中，grna可以是经修饰的或未修饰的。在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、dna延伸部、rna延伸部或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。在某些实施例中，rnp复合物可以包括表10中所示的rnp复合物。例如，rnp复合物可以包含包括seq id no:1051中所示的序列的grna和由seq id no:1097中所示的序列编码的cpf1变体蛋白(rnp32，表10)。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以含有一种或多种修饰。在某些实施例中，所述一种或多种修饰可以包含但不限于野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签(例如his标签)或其组合。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097、1107-09(cpf1多肽序列)或seq id no:1019-1021、1110-17(cpf1多核苷酸序列)中所示的序列编码。
9、在一个方面，本公开涉及一种改变细胞中的hbg基因的启动子的方法，所述方法包括使所述细胞与本文所公开的rnp复合物接触。在某些实施例中，改变可以包括表6中所示的一个或多个区域内的indel。在某些实施例中，改变可以包括hbg基因的启动子的ccaat盒靶区域内的indel。例如，在某些实施例中，改变可以包括chr 11(nc_000011.10):5,249,955–5,249,987(表6，区域6)、chr 11(nc_000011.10):5,254,879–5,254,909(表6，区域16)或其组合内的indel。在某些实施例中，rnp复合物可以包括grna和cpf1蛋白。在某些实施例中，grna可以包括表8中所示的rna靶向结构域。在某些实施例中，grna靶向结构域可以包括选自由seq id no:1002、1254、1258、1260、1262和1264组成的组的序列。在某些实施例中，grna可以包括表8中所示的grna序列。在某些实施例中，grna可以包括选自由seq id no:1022、1023、1041-1105组成的组的序列。在某些实施例中，grna可以被配置成在chr11:5249973、chr11:5249977(hbg1)；chr11:5250042、chr11:5250046(hbg1)；chr11:5250055、chr11:5250059(hbg1)；chr11:5250179、chr11:5250183(hbg1)；chr11:5254897、chr11:5254901(hbg2)；chr11:5254897、chr11:5254901(hbg2)；chr11:5254966、5254970(hbg2)；chr11:5254979、5254983(hbg2)(表6、表7)处提供编辑事件。
10、在一个方面，本公开涉及一种分离的细胞，其包括通过将rnp复合物递送到细胞而产生的hbg基因启动子的改变。在某些实施例中，rnp复合物可以包括grna和cpf1蛋白。在某些实施例中，grna可以是经修饰的或未修饰的。在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、dna延伸部、rna延伸部或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。在某些实施例中，rnp复合物可以包括表10中所示的rnp复合物。例如，rnp复合物可以包含包括seq id no:1051中所示的序列的grna和由seq idno:1097中所示的序列编码的cpf1变体蛋白(rnp32，表10)。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以含有一种或多种修饰。在某些实施例中，所述一种或多种修饰可以包含但不限于野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签(例如his标签)或其组合。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097、1107-09(cpf1多肽序列)或seq id no:1019-1021、1110-17(cpf1多核苷酸序列)中所示的序列编码。
11、在一个方面，本公开涉及一种通过使用包括grna和cpf1 rna向导的核酸酶或其变体的rnp复合物进行基因组编辑来增加人细胞中胎儿血红蛋白(hbf)水平的离体方法，以影响hbg基因启动子的改变，从而增加hbf的表达。在某些实施例中，grna可以是经修饰的或未修饰的。在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、dna延伸部、rna延伸部或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。在某些实施例中，rnp复合物可以包括表10中所示的rnp复合物。例如，rnp复合物可以包含包括seq id no:1051中所示的序列的grna和由seq id no:1097中所示的序列编码的cpf1变体蛋白(rnp32，表10)。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以含有一种或多种修饰。在某些实施例中，所述一种或多种修饰可以包含但不限于野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签(例如his标签)或其组合。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097、1107-09(cpf1多肽序列)或seq id no:1019-1021、1110-17(cpf1多核苷酸序列)中所示的序列编码。
12、在一个方面，本公开涉及一种cd34+或造血干细胞群体，其中所述群体中的一个或多个细胞包括hbg基因启动子的改变，所述改变是通过将包括grna和cpf1 rna向导的核酸酶或其变体的rnp复合物递送到cd34+或造血干细胞群体而产生的。在某些实施例中，grna可以是经修饰的或未修饰的。在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、dna延伸部、rna延伸部或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。在某些实施例中，rnp复合物可以包括表10中所示的rnp复合物。例如，rnp复合物可以包含包括seq id no:1051中所示的序列的grna和由seq id no:1097中所示的序列编码的cpf1变体蛋白(rnp32，表10)。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以含有一种或多种修饰。在某些实施例中，所述一种或多种修饰可以包含但不限于野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签(例如his标签)或其组合。在某些实施例中，cpf1变体蛋白可以由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097、1107-09(cpf1多肽序列)或seq id no:1019-1021、1110-17(cpf1多核苷酸序列)中所示的序列编码。
13、在一个方面，本公开涉及一种减轻有需要的受试者的β地中海贫血的一种或多种症状的方法，所述方法包括：a)从所述受试者中分离出cd34+或造血干细胞群体；b)通过将包括grna和cpf1 rna向导的核酸酶或其变体的rnp复合物递送到分离的细胞群体来离体修饰所述分离的细胞群体，从而影响所述群体中的一个或多个分离的细胞中的hbg基因的启动子的改变；以及c)向所述受试者施用经修饰的细胞群体，从而减轻所述受试者的β地中海贫血的一种或多种症状。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括在施用后例如至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年，检测受试者的施用的经修饰的细胞的子代/子细胞，例如以bm移植的cd34+造血干细胞或源自所述细胞的血细胞(例如，骨髓祖细胞或分化的骨髓细胞(例如，红血球、肥大细胞、成肌细胞)；或淋巴祖细胞或分化的淋巴细胞(例如，t淋巴细胞或b淋巴细胞或nk细胞)的形式。在某些实施例中，所述方法可以引起所有造血细胞谱系的重建，例如没有任何分化偏向，例如没有红系谱系分化偏向。在某些实施例中，所述方法可以包括施用多个经编辑的细胞，并且所述方法可以引起[至少5、10、15、20、25、…100]多个不同的hsc克隆在bm中的长期植入[例如施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年]。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括在施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年，检测受试者的总血红蛋白表达水平。在某些实施例中，与健康受试者相比，所述方法可以引起[至少50％、至少60％...至少99％]的总血红蛋白的长期表达[例如施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年](例如，作为总hb(例如，hba和hbf(如果有的话)组合))。在某些实施例中，改变可以包括hbg基因的启动子的ccaat盒靶区域内的indel。在某些实施例中，可以使用电穿孔递送所述rnp复合物。在某些实施例中，细胞群体中至少约5％、至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％的细胞包括生产性indel。
14、在一个方面，本公开涉及一种减轻有需要的受试者的β-地中海贫血(β-thal)的一种或多种症状的方法，所述方法包含：a)从所述受试者中分离出cd34+或造血干细胞群体；b)通过将rnp复合物递送到分离的细胞群体来离体修饰所述分离的细胞群体，从而改变所述群体中的一个或多个分离的细胞中的hbg基因的启动子，所述rnp复合物包括：cpf1和grna，所述grna包括：5'端和3'端、在所述5'端处的dna延伸部、在所述3'端处的2'-o-甲基-3'-硫代磷酸酯修饰，以及靶向结构域，所述靶向结构域与hbg基因的所述启动子中的靶位点互补；以及c)向所述受试者施用经修饰的分离的细胞群体，从而减轻所述受试者的β-thal的一种或多种症状。在某些实施例中，dna延伸部可以包含选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。在某些实施例中，靶向结构域可以包含选自由表7、8、11和12中所示的组成的组的序列。在某些实施例中，所述靶位点可以包含位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。在某些实施例中，所述cpf1可以包含一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。在某些实施例中，cpf1可以是cpf1变体并且可以包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，cpf1可以是cpf1变体并且可以包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，可以使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
15、在一个方面，本公开涉及一种诱导来自β-地中海贫血(β-thal)受试者的第一经修饰的细胞群体中的血红蛋白(hb)表达的方法，所述第一经修饰的细胞群体包括多个经修饰的cd34+或造血干细胞，所述方法包含将包含第一向导rna(grna)和cpf1的第一rnp复合物递送到来自β-thal受试者的第一未修饰的细胞群体以产生indel，所述第一未修饰的细胞群体包括多个未修饰的cd34+或造血干细胞，第一grna包含第一grna靶向结构域，其中每个经修饰的cd34+或造血干细胞包括hbg基因启动子中的indel，并且其中第一经修饰的细胞群体包括比第一未修饰的细胞群体更高的hb水平。在某些实施例中，第一grna可以包含dna延伸部，所述dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。在某些实施例中，第一grna靶向结构域可以包含选自由表7、8、11和12中所示的组成的组的序列。在某些实施例中，第一grna可以包含靶向结构域，所述靶向结构域与hbg基因的所述启动子中的靶位点互补，其中所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。在某些实施例中，第一rnp复合物可以包含cpf1变体，所述cpf1变体包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。在某些实施例中，cpf1变体可以包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，cpf1变体可以包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。在某些实施例中，可以使用电穿孔将所述第一rnp复合物递送到所述细胞。
16、在某些实施例中，经修饰的cd34+或造血干细胞可以是由经修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞。在某些实施例中，未修饰的cd34+或造血干细胞可以是由未修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞。在某些实施例中，成红细胞可以包括选自活细胞、有核细胞、使用抗人cd235a抗体通过荧光激活细胞分选(facs)发出荧光的细胞或其组合中的一种或多种。
17、在某些实施例中，相对于由未修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的由经修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞可以是晚期成红细胞。在某些实施例中，晚期成红细胞可以包括包含低或阴性cd71表达的细胞。
18、在某些实施例中，相对于由未修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞，10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的由经修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞可以是去核的红系细胞。在某些实施例中，去核的红系细胞可以是不含细胞核的红系细胞。在某些实施例中，去核的红系细胞可以包含当使用试剂(例如，nucred试剂)检测细胞核时不发出荧光(染色)的红系细胞。
19、在某些实施例中，相对于由经修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞，5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％或更多的由未修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞可以是非活成红细胞。在某些实施例中，非活成红细胞包括用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)发出荧光(染色)的细胞。
20、在某些实施例中，相对于由未修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞，由经修饰的cd34+或造血干细胞分化而来的成红细胞可能具有高5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％的总血红蛋白含量。在某些实施例中，可以使用反相超高效液相色谱法(rp-uplc)测量总血红蛋白含量。
21、在一个方面，本公开涉及一种grna，其包括5'端和3'端，并且包括在所述5'端处的dna延伸部和在所述3'端处的2'-o-甲基-3'-硫代磷酸酯修饰，其中grna包含能够与靶位点杂交的rna区段和能够与cpf1 rna向导的核酸酶缔和的rna区段。在某些实施例中，dna延伸部可以包括seq id no:1235-1250中所示的序列。在某些实施例中，grna可以是经修饰的或未修饰的。在某些实施例中，grna可以包括一种或多种修饰，所述一种或多种修饰包含硫代磷酸酯键修饰、二硫代磷酸酯(ps2)键修饰、2'-o-甲基修饰、dna延伸部、rna延伸部或其组合。在某些实施例中，dna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，rna延伸部可以包括表13中所示的序列。在某些实施例中，grna可以包括表7、8、11或12中所示的序列。
22、在一个方面，本公开涉及一种rnp复合物，其包括如本文所公开的cpf1 rna向导的核酸酶和如本文所公开的grna。
23、本文还提供了基因组编辑系统、向导rna以及用于改变一个或多个γ-珠蛋白基因(例如hbg1、hbg2或hbg1和hbg2)并增加胎儿血红蛋白(hbf)的表达的crispr介导的方法。在某些实施例中，包括表7、8、11或12中所示的序列的一个或多个grna可以用于在hbg基因的启动子区域中引入改变。在某些实施例中，基因组编辑系统、向导rna和crispr介导的方法可能会改变作为hbg1、hbg2或hbg1和hbg2基因的转录位点5'的13核苷酸(nt)靶区域(“13nt靶区域”)。在某些实施例中，基因组编辑系统、向导rna和crispr介导的方法可能会改变作为hbg1、hbg2或hbg1和hbg2基因的转录位点5'的ccaat盒靶区域(“ccaat盒靶区域”)。在某些实施例中，ccaat盒靶区域可以是远端ccaat盒处或附近的区域，并且包含远端ccaat盒的核苷酸以及远端ccaat盒上游(5')的25个核苷酸和下游(3')的25个核苷酸(即，hbg1/2c.-86至-140)。在某些实施例中，ccaat盒靶区域可以是远端ccaat盒处或附近的区域，并且包含远端ccaat盒的核苷酸以及远端ccaat盒上游(5')的5个核苷酸和下游(3')的5个核苷酸(即，hbg1/2c.-106至-120。在某些实施例中，ccaat盒靶区域可以包括如本文所公开的18nt靶区域、13nt靶区域、11nt靶区域、4nt靶区域、1nt靶区域、-117g>a靶区域或其组合。在某些实施例中，改变可以是hbg1、hbg2或hbg1和hbg2基因或其组合的18nt缺失、13nt缺失、11nt缺失、4nt缺失、1nt缺失、c.-117处从g到a的取代。在某些实施例中，改变可以是非天然存在的改变或天然存在的改变。
24、在某些实施例中，基因组编辑系统、向导rna以及用于改变一个或多个γ-珠蛋白基因(例如hbg1、hbg2或hbg1和hbg2)的crispr介导的方法可以包含rna向导的核酸酶。在某些实施例中，rna向导的核酸酶可以是如本文所公开的cpf1或经修饰的cpf1。
25、在一方面，本公开涉及组合物，所述组合物包含：通过上文所公开的方法产生的多个细胞，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包含人hbg1或hbg2基因的13nt靶区域的序列的改变；或通过上文所公开的方法产生的多个细胞，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包含人hbg1或hbg2基因的13nt靶区域的序列的改变。在某些实施例中，所述多个细胞的至少一部分可以在红系谱系内。在某些实施例中，所述多个细胞的特征在于相对于未修饰的多个细胞胎儿血红蛋白表达水平增加。在某些实施例中，胎儿血红蛋白水平可以增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施例中，组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂。
26、本文的本公开还涉及改变细胞的方法，所述方法包含使细胞与本文所公开的基因组编辑系统中的任何基因组编辑系统接触。在某些实施例中，接触细胞的步骤可以包括使细胞与包括第一和第二核糖核蛋白复合物的溶液接触。在某些实施例中，使细胞与溶液接触的步骤进一步包括电穿孔细胞，从而将第一和第二核糖核蛋白复合物引入细胞中。
27、包含上文所描述的所有特征中的任何特征的基因组编辑系统或方法可以包含包括人hbg1、hbg2基因或其组合的靶核酸。在某些实施例中，靶区域可以是人hbg1、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域。在某些实施例中，第一靶向结构域序列可以与人hbg1、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域的一侧上的第一序列互补，其中第一序列任选地与人hbg1、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域重叠。在某些实施例中，第二靶向结构域序列可以与人hbg1、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域的一侧上的第二序列互补，其中第二序列任选地与人hbg1、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域重叠。
28、在某些实施例中，细胞可以包含通过本文所公开的用于改变细胞的方法中的任何方法产生的hbg基因座的至少一个经修饰的等位基因，其中hbg基因座的经修饰的等位基因包括人hbg1基因、hbg2基因或其组合的改变。
29、在某些实施例中，分离的细胞群体可以由本文所公开的用于改变细胞的方法中的任何方法进行修饰，其中细胞群体可以包含可能与未由所述方法修饰的相同细胞类型的分离的细胞群体或其后代不同的indel分布。
30、在某些实施例中，多个细胞可以通过本文所公开的用于改变细胞的方法中的任何方法产生，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞可以包含人hbg1基因、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域中的序列的改变。
31、在某些实施例中，本文所公开的细胞可以用于药物。在某些实施例中，细胞可以用于治疗β-血红蛋白病。在某些实施例中，β-血红蛋白病可以选自由镰状细胞病和β-地中海贫血组成的组。在某些实施例中，β-地中海贫血可以是输血依赖性β地中海贫血(tdt)。
32、在一方面，本公开涉及组合物，所述组合物包含：通过上文所公开的方法产生的多个细胞，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包含人hbg1或hbg2基因的ccaat盒靶区域的序列的改变；或通过上文所公开的方法产生的多个细胞，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞包含人hbg1或hbg2的ccaat盒靶区域的序列的改变。在某些实施例中，所述多个细胞的至少一部分可以在红系谱系内。在某些实施例中，所述多个细胞的特征在于相对于未修饰的多个细胞胎儿血红蛋白表达水平增加。在某些实施例中，胎儿血红蛋白水平可以增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施例中，组合物可以进一步包含药学上可接受的载剂。
33、在一个方面，本公开涉及由上文所描述的基因组编辑系统修饰的细胞群体，其中相对于未由基因组编辑系统修饰的细胞群体，所述细胞群体包括更高百分比的生产性indel。本公开还涉及由基因组编辑系统修饰的细胞群体，其中相对于未由基因组编辑系统修饰的细胞群体，更高百分比的细胞群体能够分化成表达hbf的红系谱系的细胞群体。在某些实施例中，更高百分比可以高至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％或至少约40％。在某些实施例中，细胞可以是造血干细胞。在某些实施例中，细胞能够分化成成红细胞、红血球、或红血球或成红细胞的前体。在某些实施例中，indel可以是由微同源性介导的端连接(mmej)修复之外的修复机制产生的。
34、本公开还涉及本文所公开的细胞中的任何细胞在制造用于治疗受试者的β-血红蛋白病的药物中的用途。
35、在一个方面，本公开涉及一种治疗有需要的受试者的β-血红蛋白病的方法，所述方法包括向所述受试者施用本文所公开的细胞。在某些实施例中，一种治疗有需要的受试者的β-血红蛋白病的方法可以包含向所述受试者施用经修饰的造血细胞群体，其中已根据本文所公开的改变细胞的方法改变了一个或多个细胞。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括在施用后例如至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年，检测受试者的施用的经修饰的细胞的子代/子细胞，例如以bm移植的cd34+造血干细胞或源自所述细胞的血细胞(例如，骨髓祖细胞或分化的骨髓细胞(例如，红血球、肥大细胞、成肌细胞)；或淋巴祖细胞或分化的淋巴细胞(例如，t淋巴细胞或b淋巴细胞或nk细胞)的形式。在某些实施例中，所述方法可以引起所有造血细胞谱系的重建，例如没有任何分化偏向，例如没有红系谱系分化偏向。在某些实施例中，所述方法可以包括施用多个经编辑的细胞，并且所述方法可以引起[至少5、10、15、20、25、…100]多个不同的hsc克隆在bm中的长期植入[例如施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年]。在某些实施例中，所述方法可以进一步包括在施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年，检测受试者的总血红蛋白表达水平。在某些实施例中，与健康受试者相比，所述方法可以引起[至少50％、至少60％...至少99％]的总血红蛋白的长期表达[例如施用后至少[1、2、3、4、5、6、7、8、12、16或20]周或至少[1、2、3、4、5或6]个月或至少[1、2、3、4或5]年(例如，作为总hb(例如，hba和hbf(如果有的话)组合))。在某些实施例中，改变可以包括hbg基因的启动子的ccaat盒靶区域内的indel。
36、在一个方面，本公开涉及一种改变细胞的方法，所述方法包括使细胞与基因组编辑系统接触。在某些实施例中，使细胞与基因组编辑系统接触的步骤可以包括使细胞与包括第一和第二核糖核蛋白复合物的溶液接触。在某些实施例中，使细胞与溶液接触的步骤可以进一步包括电穿孔细胞，从而将第一和第二核糖核蛋白复合物引入细胞中。在某些实施例中，改变细胞的方法可以进一步包括使细胞与基因组编辑系统接触，其中使细胞与基因组编辑系统接触的步骤可以包括使细胞与包括第一、第二、第三和任选地第四核糖核蛋白复合物的溶液接触。在某些实施例中，使细胞与溶液接触的步骤可以进一步包括电穿孔细胞，从而将第一、第二、第三和任选地第四核糖核蛋白复合物引入细胞中。在某些实施例中，细胞能够分化成成红细胞、红血球、或红血球或成红细胞的前体。在某些实施例中，所述细胞可以是cd34+细胞。
37、在一方面，本公开涉及一种组合物，其可以包括通过本文所公开的改变细胞的方法产生的多个细胞，其中至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的细胞可以包括人hbg1基因、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域的序列的改变。在某些实施例中，所述多个细胞的至少一部分可以在红系谱系内。在某些实施例中，所述多个细胞的特征在于相对于未修饰的多个细胞胎儿血红蛋白表达水平增加。在某些实施例中，胎儿血红蛋白水平可以增加至少20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％。在某些实施例中，组合物可以进一步包括药学上可接受的载剂。
38、在一个方面，本公开涉及一种细胞，其包括通过本文所公开的改变细胞的方法产生的合成基因型，其中所述细胞可以包括人hbg1基因、hbg2基因或其组合的18nt缺失、11nt缺失、4nt缺失、1nt缺失、13nt缺失、-117处从g到a的取代。
39、在一个方面，本公开涉及一种细胞，其包括通过本文所公开的改变细胞的方法产生的hbg基因座的至少一个等位基因，其中所述细胞可以编码人hbg1基因、hbg2基因或其组合的18nt缺失、11nt缺失、4nt缺失、1nt缺失、13nt缺失、-117处从g到a的取代。
40、在一方面，本公开涉及一种组合物，其包括通过本文所公开的改变细胞的方法产生的细胞群体，其中所述细胞包括相对于未修饰的细胞群体，人hbg1基因、hbg2基因或其组合的ccaat盒靶区域的序列的更高频率的改变。在某些实施例中，更高频率是至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％高。在某些实施例中，细胞群体的至少一部分在红系谱系内。
41、此列表旨在是示例性和说明性的，而不是全面性和限制性的。另外的方面和实施例可以在本公开的其余部分和权利要求中所示或显而易见。
1.一种减轻有需要的受试者的β-地中海贫血(β-thal)的一种或多种症状的方法，所述方法包括：
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述靶向结构域包括表7、8、11和12中所示的序列或由所述序列组成。
4.根据权利要求1至3所述的方法，其中所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。
5.根据权利要求1至4所述的方法，其中所述cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。
6.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。
7.根据权利要求1至5所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。
8.根据权利要求1至7所述的方法，其中使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
9.一种诱导来自β-地中海贫血(β-thal)受试者的cd34+或造血干细胞群体中的血红蛋白(hb)表达的方法，所述方法包括：
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述grna包括dna延伸部，所述dna延伸部包括选自由seq id no:1235-1250组成的组的序列。
11.根据权利要求9或10所述的方法，其中所述grna靶向结构域包括表7、8、11和12中所示的序列或由所述序列组成。
12.根据权利要求9至11所述的方法，其中所述grna包括靶向结构域，所述靶向结构域与hbg基因的所述启动子中的靶位点互补，其中所述靶位点包括位于chr 11(nc_000011.10)5,249,904–5,249,927(表6，区域6)；chr 11(nc_000011.10)5,254,879–5,254,909(表6，区域16)；或其组合之间的核苷酸。
13.根据权利要求9至12所述的方法，其中所述rnp复合物包括cpf1，所述cpf1包括一种或多种选自由以下组成的组的修饰：野生型cpf1氨基酸序列中的一种或多种突变、野生型cpf1核酸序列中的一种或多种突变、一种或多种核定位信号(nls)、一种或多种纯化标签和其组合。
14.根据权利要求9至13所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1000、1001、1008-1018、1032、1035-39、1094-1097和1107-09组成的组的序列或由所述序列组成。
15.根据权利要求9至14所述的方法，其中所述cpf1包括选自由seq id no:1019-1021和1110-17组成的组的序列或由所述序列组成。
16.根据权利要求9至15所述的方法，其中使用电穿孔将所述rnp复合物递送到所述细胞。
