本公开总体上涉及抗体癌症疗法的，并且更具体地涉及双特异性四价抗体。
背景技术：
1、人表皮生长因子受体(egfr，也称为erbb1、her1)家族具有四个成员egfr、her2、her3和her4。通过突变、扩增和过表达使每个家族成员失调在肿瘤发生和肿瘤转移方面起着重要作用。过表达与多种肿瘤的发展相关，包括但不限于乳腺癌、卵巢癌、胃癌(stomachcancer/gastric cancer)、肺腺癌、侵袭性形式的子宫癌和唾液腺管癌。以乳腺癌为例，在30％的乳腺癌患者中出现her2的过表达，并且潜在的her2突变和扩增产生异常的生长信号，该信号活化其下游信号传导途径，从而导致肿瘤发生。在her2测试呈阴性的乳腺癌亚型中，至少50％的三阴性乳腺癌(雌激素和孕酮受体以及her2蛋白测试呈阴性)中过表达egfr。约20％-30％的侵袭性形式的乳腺癌中过表达her3。her3是该家族中唯一无催化活性并且需要与其它待活化成员二聚化的成员。例如，her3可与肿瘤细胞表面上的her2二聚化，活化促进肿瘤生长和存活的pi3k/akt信号传导。
2、通过阻断受体细胞外结构域上的egfr结合位点或通过抑制细胞内酪氨酸激酶活性来中断egfr信号传导可预防表达egfr的肿瘤的生长，并且改善患者的病况。几种抗egfr抗体，包括西妥昔单抗、帕尼单抗和尼妥珠单抗，被批准用于治疗转移性结肠直肠癌、头颈部鳞状细胞癌和神经胶质瘤(price和cohen，2012；bode等人，2012)。曲妥珠单抗(赫塞汀)和靶向her2的其它药剂在患有表达her2的乳腺癌和胃癌的患者中具有抗肿瘤功效。然而，曲妥珠单抗仅在her2过表达的癌症中有效。最初对这些治疗剂有反应的许多肿瘤最终会由于对这些药剂的获得性耐药性而进展，并且长期益处在一些患者中似乎有限。以her2靶向疗法为例，耐药性可经由her3或其配体hrg的上调而发生。然而，目前旨在抑制her2/her3信号传导途径活化的治疗性方法未能提供有意义的临床益处(geuijen等人，2018；yu等人，2019)。本公开涉及制备和使用靶向egfr和her3的双特异性四价抗体用于治疗癌症患者的方法。
技术实现思路
1、以下
技术实现要素：
仅是说明性的，并不旨在以任何方式进行限制。除了上述说明性方面、实施方案和特征之外，通过参考附图和以下详细描述，其它方面、实施方案和特征将变得显而易见。
2、本公开提供了靶向egfr家族的两个成员egfr和her3的双特异性四价抗体，以及制备和使用该抗体的方法。双特异性四价抗体可包含具有两条重链和两条轻链的免疫球蛋白g(igg)部分，以及与重链的n末端或者轻链的n末端或c末端共价连接的两个scfv部分。igg部分可对egfr家族的第一个成员具有结合特异性。scfv部分可对egfr家族的第二个成员具有结合特异性。igg部分和两个scfv部分共价连接，作为双特异性抗体起作用。通过以下结合附图对本公开的优选实施方案的详细描述，本公开的目的和优点将变得显而易见。
3、一方面，本技术提供了一种双特异性抗体，其包含两组重链和轻链。每组重链和轻链形成对egfr具有结合特异性的fab区。抗体还可包含与重链的n末端、轻链的n末端或轻链的c末端共价连接的scfv结构域。scfv结构域对her3具有结合特异性。在一个实施方案中，双特异性抗体包含igg结构域。在一个实施方案中，双特异性抗体包含igg1结构域。
4、在一个实施方案中，scfv结构域可与重链的n末端连接。在一个实施方案中，scfv结构域可与轻链的n末端或c末端连接。
5、在一个实施方案中，scfv结构域与轻链的n末端或c末端连接，其中轻链包含与seqid no.1、3、5、7或9具有序列同一性的氨基酸序列。
6、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.17、23或24具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
7、在一个实施方案中，scfv结构域与重链的n末端连接，其中重链包含与seq idno.2、4、6、8或10具有序列同一性的氨基酸序列。
8、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.22具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
9、在一个实施方案中，重链可包含具有seq id no.31、32和33的氨基酸序列的3个互补决定区(cdr)。在一个实施方案中，重链可包含具有seq id no.37、38和39的氨基酸序列的3个cdr。
10、在一个实施方案中，轻链可包含具有seq id no.34、35和36的氨基酸序列的3个cdr。在一个实施方案中，轻链可包含具有seq id no.40、41和42的氨基酸序列的3个cdr。
11、在一个实施方案中，抗体可包含igg恒定区，其中igg恒定区包含与seq id no.19具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
12、在一个实施方案中，抗体可包含κ恒定区，其中κ恒定区包含与seq id no.20具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
13、在一个实施方案中，scfv结构域可包含与seq id no.11、12、13、14、15或16具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
14、在一个实施方案中，scfv结构域可包含可变轻链(vl)，其中vl具有与seq idno.11、13或15具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，vl包含具有seq id no.46、47和48的氨基酸序列的cdr。
15、在一个实施方案中，scfv结构域可包含可变重链(vh)，其中vh具有与seq idno.12、14或16具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，vh包含具有seq id no.43、44和45的氨基酸序列的cdr。
16、在一个实施方案中，scfv结构域从n末端到c末端可具有vlvh或vhvl构型。在一个实施方案中，scfv可包含vl和vh之间的二硫键。在一个实施方案中，二硫键可以在scfv结构域的vl100和vh44(kabat)之间。在一个实施方案中，scfv可包含r19s(kabat)突变。
17、在一个实施方案中，scfv结构域包含具有与seq id no.11具有序列同一性的氨基酸序列的vl以及具有与seq id no.12具有序列同一性的氨基酸序列的vh。在一个实施方案中，scfv包含具有与seq id no.13具有序列同一性的氨基酸序列的vl以及具有与seq idno.14具有序列同一性的氨基酸序列的vh。在另一实施方案中，scfv包含具有与seq idno.15具有序列同一性的氨基酸序列的vl以及具有与seq id no.16具有序列同一性的氨基酸序列的vh。
18、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.18具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且抗体可包含与seq idno.17具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
19、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.22具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且抗体可包含与seq idno.21具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
20、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.18具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且抗体可包含与seq idno.23具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
21、在一个实施方案中，抗体可包含与seq id no.25具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列，并且抗体可包含与seq idno.24具有至少50％、60％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％序列同一性的氨基酸序列。
22、另一方面，本技术提供了一种分离的核酸，其编码如本文公开的双特异性抗体。
23、又一方面，本技术提供了一种表达载体，其包含编码如本文公开的双特异性抗体的分离的核酸。在一个实施方案中，表达载体可以在细胞中表达。
24、又一方面，本技术提供了一种宿主细胞，其包含如本文公开的核酸。
25、又一方面，本技术提供了产生如本文公开的双特异性抗体的方法。该方法包括培养如本文公开的宿主细胞，以便产生双特异性抗体的步骤。
26、又一方面，本技术提供了免疫缀合物，其包含双特异性抗体和细胞毒性剂，其中细胞毒性剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。
27、又一方面，本技术提供了药物组合物，其包含双特异性抗体和药学上可接受的载体。在一个实施方案中，药物组合物可包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。在一个实施方案中，药物组合物可包含免疫缀合物和药学上可接受的载体。
28、又一方面，本技术提供了治疗患有癌症的受试者的方法。在一个实施方案中，该方法可包括向受试者施用有效量的双特异性抗体的步骤。在一个实施方案中，癌症可包括表达egfr、her3或两者的细胞。在一个实施方案中，癌症可包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。
29、在一个实施方案中，该方法还包括共施用有效量的治疗剂。
30、在一个实施方案中，治疗剂可包括抗体、化疗剂、酶或其组合。在一个实施方案中，治疗剂可包括卡培他滨、顺铂、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏罗唑、福美司坦、法倔唑、来曲唑、埃罗替尼、拉法替尼(lafatinib)、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑帕尼(pazopinib)、拉帕替尼、舒尼替尼、尼罗替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇(nab-palitaxel)、其衍生物或组合。
31、在一个实施方案中，受试者是人。
32、又一方面，本技术提供了一种溶液，其包含有效浓度的双特异性抗体。在一个实施方案中，溶液是受试者的血浆。
1.一种双特异性抗体，其包含两组重链和轻链，
2.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域与所述重链的所述n末端连接，并且其中所述抗体包含与seq id no.22具有序列同一性的氨基酸序列。
3.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域与所述轻链的所述n末端或c末端连接，并且其中所述抗体包含与seq id no.17、23或24具有序列同一性的氨基酸序列。
4.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其包含与seq id no.17、22、23或24具有至少98％序列同一性的抗原结合结构域。
5.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述重链包含恒定区，其中所述恒定区包含与seq id no.19具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
6.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述轻链包含κ恒定区，其中所述κ恒定区包含与seq id no.20具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
7.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含与seq id no.11、12、13、14、15或16具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
8.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含可变轻链，其中所述可变轻链具有与seq id no.11、13或15具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
9.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含可变重链，其中所述可变重链具有与seq id no.12、14或16具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
10.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含可变轻链(vl)和可变重链(vh)，其中所述scfv结构域从n末端到c末端具有vlvh或vhvl构型。
11.根据权利要求10所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含vl和vh之间的二硫键。
12.根据权利要求11所述的双特异性抗体，其中所述二硫键在所述scfv结构域的vl100和vh44(kabat)之间。
13.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述scfv结构域包含r19s(kabat)突变。
14.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含与seq id no.17和18具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
15.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含与seq id no.21和22具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
16.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含与seq id no.18和23具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
17.根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述抗体包含与seq id no.24和25具有至少98％序列同一性的氨基酸序列。
18.一种分离的核酸，其编码根据权利要求1所述的双特异性抗体。
19.一种表达载体，其包含根据权利要求18所述的分离的核酸。
20.根据权利要求19所述的表达载体，其中所述载体在细胞中表达。
21.一种宿主细胞，其包含根据权利要求18所述的核酸。
22.一种产生根据权利要求1所述的双特异性抗体的方法，其包括培养根据权利要求21所述的宿主细胞，以便产生所述双特异性抗体。
23.一种免疫缀合物，其包含根据权利要求1所述的双特异性抗体和细胞毒性剂，其中所述细胞毒性剂包括化疗剂、生长抑制剂、毒素或放射性同位素。
24.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的双特异性抗体和药学上可接受的载体。
25.根据权利要求24所述的药物组合物，其还包含放射性同位素、放射性核素、毒素、治疗剂、化疗剂或其组合。
26.一种药物组合物，其包含根据权利要求23所述的免疫缀合物和药学上可接受的载体。
27.一种治疗患有癌症的受试者的方法，其包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1所述的双特异性抗体。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述癌症包括表达egfr、her3或两者的细胞，或其中所述癌症包括乳腺癌、结肠直肠癌、胰腺癌、头颈癌、黑素瘤、卵巢癌、前列腺癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、神经胶质瘤、食道癌、鼻咽癌、肾癌、胃癌、肝癌、膀胱癌、宫颈癌、脑癌、淋巴瘤、白血病、骨髓瘤。
29.根据权利要求27所述的方法，其还包括共施用有效量的治疗剂。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述治疗剂包括抗体、化疗剂、酶或其组合，并且其中所述治疗剂包括卡培他滨、顺铂、曲妥珠单抗、氟维司群、他莫昔芬、来曲唑、依西美坦、阿那曲唑、氨鲁米特、睾内酯、伏罗唑、福美司坦、法倔唑、来曲唑、埃罗替尼、拉法替尼、达沙替尼、吉非替尼、伊马替尼、帕唑帕尼、拉帕替尼、舒尼替尼、尼罗替尼、索拉非尼、nab-紫杉醇、其衍生物或组合。
31.根据权利要求27所述的方法，其中所述受试者是人。
32.一种溶液，其包含有效浓度的根据权利要求1所述的双特异性抗体，其中所述溶液是受试者的血浆。
