本发明涉及生物医学领域。具体地，本发明涉及来自假单胞菌属(pseudomonassp.)的物种的活细菌菌株(诸如铜绿假单胞菌(pseudomonas aeruginosa))及其用途。更具体地，本发明涉及一种oprf活性降低的铜绿假单胞菌的活细菌菌株，一种包含所述活细菌菌株的抗铜绿假单胞菌感染的疫苗，以及一种用于通过施用所述活细菌菌株来预防和/或治疗受试者的铜绿假单胞菌感染的方法。
背景技术：
1、铜绿假单胞菌是一种普遍存在的革兰氏阴性细菌，其能够在广泛的自然环境中存活。它还是与医院获得性感染(诸如免疫受损患者的败血症、肠和肺部感染)相关的机会性人体病原体，也是患有囊性纤维化的个体发病和死亡的主要原因。由于铜绿假单胞菌能够抵抗许多目前可用的抗生素，因此对这种细菌的治疗已成为一个巨大的挑战。已知铜绿假单胞菌菌株利用其高水平的内在和获得性耐药机制来抵抗大多数抗生素。此外，铜绿假单胞菌的适应性抗生素耐药是一种最新揭示的机制，该机制包括生物膜介导的耐药和多重耐药持久性细胞的形成，并会导致顽固感染和复发感染1。该机会性病原体的适应性阻碍了抗菌疗法的发展，因此，它仍然是对公共卫生的主要威胁。
2、铜绿假单胞菌最初被分类为细胞外病原体。然而，许多报道强调了其能够进入宿主细胞，导致细胞内驻留阶段，这可能是传统的细胞外感染之外的重要感染。最近，铜绿假单胞菌已被证明位于培养的巨噬细胞内。对该细菌在巨噬细胞内的命运研究发现，铜绿假单胞菌的液泡逃逸以及由细胞内细菌驱动的巨噬细胞死亡，很可能与细菌的胞质位置有关2。还研究了涉及该巨噬细胞内步骤的细菌因素。其中，已发现oprf是参与铜绿假单胞菌在巨噬细胞内存活的关键因素之一3。
3、oprf是一种主要的外膜孔蛋白，其参与细胞结构的维持、外膜通透性、环境感应、黏附、生物膜形成和毒力。它允许离子物质和小的极性营养物的非特异性扩散，包括分子量高达1.5kda的多糖4。oprf将om锚定到肽聚糖层上，并且参与宿主-病原体相互作用。oprf的缺乏导致生物膜形成增加和产生pel胞外多糖，并且被证明是表达完全毒力所必需的5,6。此外，最近的研究表明oprf调节iii型分泌系统(t3ss)基因的转录。t3ss及其exos效应子在铜绿假单胞菌的巨噬细胞内生存中发挥主要作用，使内化的细菌逃脱吞噬体并促进巨噬细胞裂解。与oprf对t3ss基因转录的作用一致，oprf调节t3ss pcrv cap蛋白的产生以及exot毒素和exos毒素的分泌3。此外，oprf还调节群体感应依赖性毒力因子绿脓菌素、弹性蛋白酶、凝集素pa-1l和外毒素a的产生5，表明oprf充当宿主免疫系统的传感器，并在铜绿假单胞菌感染的宿主免疫逃逸中发挥作用。
4、由于其抗微生物耐药性，疫苗代表了一种应对病原体的替代策略，尽管对抗假单胞菌疫苗进行了50多年的研究，但尚未有疫苗获得许可7。仍然需要其他方法来产生有效的疫苗。
技术实现思路
1、随着基因组修饰技术的快速发展，在疫苗中利用合成细菌载体已成为有前景的策略之一。本研究的目的是构建一种细菌疫苗载体，该细菌疫苗载体可使用有效的抗原展示进行调节，并在各种铜绿假单胞菌感染模型中引发免疫原性。针对靶向铜绿假单胞菌的免疫逃逸，通过敲除铜绿假单胞菌中的oprf基因来设计出低毒力。通过这样做，新型减毒菌株在小鼠模型中进一步表现出高免疫原性。
2、在这方面，本发明提供至少以下实施方案：
3、实施方案1.一种来自假单胞菌属的物种的活细菌菌株，其中例如与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株缺乏oprf活性或具有降低的oprf活性，并且/或者所述活细菌菌株中oprf基因的表达减少，并且/或者本发明的所述活细菌菌株含有oprf基因的突变。
4、实施方案2.根据实施方案1所述的活细菌菌株，其中来自假单胞菌属的所述物种是铜绿假单胞菌。
5、实施方案3.根据实施方案1或2所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株中的oprf活性降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多，优选地，所述活细菌菌株缺乏oprf活性。
6、实施方案4.根据实施方案1至3中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株中oprf基因的表达减少，例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多，优选地，所述活细菌菌株缺乏oprf基因表达。
7、实施方案5.根据实施方案1至4中任一项所述的活细菌菌株，其中所述oprf基因编码具有与seq id no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或具有seq id no:1的氨基酸序列的oprf蛋白。
8、实施方案6.根据实施方案1至5中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株含有导致oprf活性降低或缺乏的oprf基因的突变。
9、实施方案7.根据实施方案6所述的活细菌菌株，其中所述oprf基因的突变导致所述oprf蛋白的表达减少，或导致活性降低的突变oprf蛋白的表达，优选地，所述oprf基因的所述突变导致oprf蛋白不表达，或导致无活性的突变oprf蛋白的表达。
10、实施方案8.根据实施方案6或7所述的活细菌菌株，其中所述突变包括所述oprf基因的缺失，例如，所述oprf基因的完全缺失或部分缺失。
11、实施方案9.根据实施方案6至8中任一项所述的活细菌菌株，所述突变通过同源重组或通过靶向诱变，诸如经由crispr、talen或zfn技术来实现。
12、实施方案10.根据实施方案1至9中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株具有降低的毒力，例如所述活细菌菌株的所述毒力降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。
13、实施方案11.根据实施方案1至10中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株具有增加的免疫原性，例如所述活细菌菌株的所述免疫原性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％或更多。
14、实施方案12.根据实施方案1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于作为临床分离物的亲代菌株。
15、实施方案13.根据实施方案1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于已具有低毒力的亲代菌株。
16、实施方案14.根据实施方案1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于铜绿假单胞菌菌株pao1或pa14。
17、实施方案15.根据实施方案1至14中任一项所述的活细菌菌株，所述活细菌菌株用作表达目标蛋白质的活表达载体。
18、实施方案16.根据实施方案1至15中任一项所述的活细菌菌株，所述活细菌菌株还包含目标蛋白质的编码序列，并且由此能够表达所述目标蛋白质。
19、实施方案17.根据实施方案16所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质的编码序列被引入所述活细菌菌株中，例如通过核酸表达构建体。
20、实施方案18.根据实施方案17所述的活细菌菌株，其中所引入的所述目标蛋白质的编码序列整合到所述活细菌菌株的基因组中。
21、实施方案19.根据实施方案16至18中任一项所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质表达并展示在所述活细菌菌株的细胞表面上；或者所述目标蛋白质表达并分泌出所述活细菌菌株的细胞。
22、实施方案20.根据实施方案16至19中任一项所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质选自抗体或抗原，优选地，所述目标蛋白质是抗原，
23、例如，所述抗原选自：来自铜绿假单胞菌的pcrv、opri或oprjnm；来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的adsa、esxa、esxb、pmta或pmtc；或来自肺炎链球菌(s.pneumoniae)的pspa。
24、实施方案21.根据实施方案1至20中任一项所述的活细菌菌株在制备用于预防或治疗细菌感染的组合物诸如疫苗中的用途。
25、实施方案22.根据实施方案21所述的用途，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
26、实施方案23.一种用于预防或治疗细菌感染的组合物，诸如疫苗，所述组合物包含根据实施方案1至20中任一项所述的活细菌菌株。
27、实施方案24.根据实施方案23所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂和/或药学上可接受的载体。
28、实施方案25.根据实施方案23或24所述的用途，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
29、实施方案26.一种用于预防和/或治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据实施方案1至20中任一项所述的活细菌菌株，或根据实施方案24或25所述的组合物。
30、实施方案27.根据实施方案26所述的方法，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
31、实施方案28.一种用于产生来自假单胞菌属的物种的具有降低的毒力和/或增加的免疫原性的活细菌菌株的方法，所述方法包括降低所述活细菌菌株中的oprf活性，以及/或者减少所述活细菌菌株中oprf基因的表达，以及/或者将突变引入所述活细菌菌株的oprf基因中。
32、实施方案29.根据实施方案28所述的方法，其中所述方法包括减少所述活细菌菌株的oprf基因的表达。
33、实施方案30.根据实施方案28或29所述的方法，其中所述方法包括将突变引入所述活细菌菌株的oprf基因中。
34、实施方案31.根据实施方案30所述的方法，其中所述突变包括所述oprf基因的完全缺失或部分缺失。
35、实施方案32.根据实施方案30或31所述的方法，其中所述突变导致所述oprf蛋白的表达减少或不表达。
36、实施方案33.根据实施方案30或31所述的方法，其中所述突变导致活性降低或无活性的突变oprf蛋白。
37、实施方案34.根据实施方案28至33中任一项所述的方法，其中来自假单胞菌属的所述物种是铜绿假单胞菌。
38、实施方案35.根据实施方案29至33中任一项所述的方法，其中所述oprf基因编码具有与seq id no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或具有seq id no:1所示的氨基酸序列的oprf蛋白。
39、实施方案36.根据实施方案28至35中任一项所述的方法，其中所述突变通过同源重组例如双同源重组，或通过靶向诱变诸如经由crispr、talen或zfn技术来实现。
40、实施方案37.根据实施方案28至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将目标蛋白质的编码序列引入所述活细菌菌株中，由此使得所述活细菌菌株能够表达所述目标蛋白质。
41、实施方案38.根据实施方案37所述的方法，其中通过核酸表达构建体将所述目标蛋白质的所述编码序列引入所述活细菌菌株中。
42、实施方案39.根据实施方案37或38所述的方法，其中所引入的所述目标蛋白质的编码序列整合到所述活细菌菌株的所述基因组中。
43、实施方案40.根据实施方案37至39中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白质选自抗体和抗原，优选抗原，
44、例如，所述抗原选自：来自铜绿假单胞菌的pcrv、opri或oprjnm；来自金黄色葡萄球菌(s.aureus)的adsa、esxa、esxb、pmta或pmtc；或来自肺炎链球菌(s.pneumoniae)的pspa。
1.一种来自假单胞菌属的物种的活细菌菌株，其中例如与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株缺乏oprf活性或具有降低的oprf活性，并且/或者所述活细菌菌株中oprf基因的表达减少，并且/或者所述活细菌菌株含有所述oprf基因的突变。
2.根据权利要求1所述的活细菌菌株，其中来自假单胞菌属的所述物种是铜绿假单胞菌。
3.根据权利要求1或2所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株中的oprf活性降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多，优选地，所述活细菌菌株缺乏oprf活性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株中oprf基因的表达减少，例如减少至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多，优选地，所述活细菌菌株缺乏oprf基因表达。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的活细菌菌株，其中所述oprf基因编码具有与seqid no:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或具有seq id no:1的氨基酸序列的oprf蛋白。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株含有导致oprf活性降低或缺乏的所述oprf基因的突变。
7.根据权利要求6所述的活细菌菌株，其中所述oprf基因的突变导致所述oprf蛋白的表达减少，或导致活性降低的突变oprf蛋白的表达，优选地，所述oprf基因的突变导致oprf蛋白不表达，或导致无活性的突变oprf蛋白的表达。
8.根据权利要求6或7所述的活细菌菌株，其中所述突变包括所述oprf基因的缺失，例如，所述oprf基因的完全缺失或部分缺失。
9.根据权利要求6至8中任一项所述的活细菌菌株，所述突变通过同源重组或通过靶向诱变，诸如经由crispr、talen或zfn技术来实现。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株具有降低的毒力，例如所述活细菌菌株的所述毒力降低至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％或至少约90％或更多。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的活细菌菌株，其中与相应的对照菌株相比，所述活细菌菌株具有增加的免疫原性，例如所述活细菌菌株的所述免疫原性增加至少约10％、至少约20％、至少约30％、至少约40％、至少约50％、至少约60％、至少约70％、至少约80％、至少约90％、至少约100％、至少约150％、至少约200％、至少约250％、至少约300％或更多。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于作为临床分离物的亲代菌株。
13.根据权利要求1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于已具有低毒力的亲代菌株。
14.根据权利要求1至11中任一项所述的活细菌菌株，其中所述活细菌菌株来源于铜绿假单胞菌菌株pao1或pa14。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的活细菌菌株，所述活细菌菌株用作表达目标蛋白质的活表达载体。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的活细菌菌株，所述活细菌菌株还包含目标蛋白质的编码序列，并且由此能够表达所述目标蛋白质。
17.根据权利要求16所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质的编码序列被引入所述活细菌菌株中，例如通过核酸表达构建体。
18.根据权利要求17所述的活细菌菌株，其中所引入的所述目标蛋白质的编码序列整合到所述活细菌菌株的基因组中。
19.根据权利要求16至18中任一项所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质表达并展示在所述活细菌菌株的细胞表面上；或者所述目标蛋白质表达并分泌出所述活细菌菌株的细胞。
20.根据权利要求16至19中任一项所述的活细菌菌株，其中所述目标蛋白质选自抗体或抗原，优选地，所述目标蛋白质是抗原，
21.根据权利要求1至20中任一项所述的活细菌菌株在制备用于预防或治疗细菌感染的组合物诸如疫苗中的用途。
22.根据权利要求21所述的用途，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
23.一种组合物，诸如疫苗，其用于预防或治疗细菌感染，所述组合物包含根据权利要求1至20中任一项所述的活细菌菌株。
24.根据权利要求23所述的组合物，其中所述组合物还包含佐剂和/或药学上可接受的载体。
25.根据权利要求23或24所述的用途，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
26.一种用于预防和/或治疗受试者的细菌感染的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的根据权利要求1至20中任一项所述的活细菌菌株，或根据权利要求24或25所述的组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述细菌感染是由来自假单胞菌属的物种诸如铜绿假单胞菌引起的感染。
28.一种用于产生来自假单胞菌属的物种的具有降低的毒力和/或增加的免疫原性的活细菌菌株的方法，所述方法包括降低所述活细菌菌株中的oprf活性，以及/或者减少所述活细菌菌株中oprf基因的表达，以及/或者将突变引入所述活细菌菌株的oprf基因中。
29.根据权利要求28所述的方法，其中所述方法包括减少所述活细菌菌株的oprf基因的表达。
30.根据权利要求28或29所述的方法，其中所述方法包括将突变引入所述活细菌菌株的oprf基因中。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述突变包括所述oprf基因的完全缺失或部分缺失。
32.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述突变导致所述oprf蛋白的表达减少或不表达。
33.根据权利要求30或31所述的方法，其中所述突变导致活性降低或无活性的突变oprf蛋白。
34.根据权利要求28至33中任一项所述的方法，其中来自假单胞菌属的所述物种是铜绿假单胞菌。
35.根据权利要求29至33中任一项所述的方法，其中所述oprf基因编码具有与seq idno:1具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.1％、至少99.2％、至少99.3％、至少99.4％、至少99.5％、至少99.6％、至少99.7％、至少99.8％、至少99.9％序列同一性的氨基酸序列或具有seq id no:1所示的氨基酸序列的oprf蛋白。
36.根据权利要求28至35中任一项所述的方法，其中所述突变通过同源重组例如双同源重组，或通过靶向诱变诸如经由crispr、talen或zfn技术来实现。
37.根据权利要求28至36中任一项所述的方法，其中所述方法还包括将目标蛋白质的编码序列引入所述活细菌菌株中，由此使得所述活细菌菌株能够表达所述目标蛋白质。
38.根据权利要求37所述的方法，其中通过核酸表达构建体将所述目标蛋白质的编码序列引入所述活细菌菌株中。
39.根据权利要求37或38所述的方法，其中所引入的所述目标蛋白质的编码序列整合到所述活细菌菌株的所述基因组中。
40.根据权利要求37至39中任一项所述的方法，其中所述目标蛋白质选自抗体或抗原，优选抗原，
