本发明属于传感器，具体为公开一种基于双纳米抗体dna纳米结构的场效应晶体管传感器及制备方法和用于检测目标抗原的应用。
背景技术：
1、抗原检测是一种常用的疾病检测手段，具有快筛、成本低、能够大规模生产等特点，因此得到了广泛关注。因此，迫切需要开发快速、精准、低成本的检测技术，有效遏制疫情的扩散蔓延。新冠病毒检测的对象主要包含抗原、抗体和核酸。其中，核酸检测是最常用的检测手段，尤其是作为金标准的qrt-pcr技术。然而该检测技术需要专门的仪器、耗时的核酸提取和扩增程序，在快速有效的大规模筛查中面临挑战。相较于核酸检测和抗体检测，病毒抗原蛋白的直接检测具有检测速度快、操作简便、无需复杂的样本处理过程且成本低的优势，使其成为一种有效地减少病毒传播和疫情蔓延的重要检测手段。
2、目前的抗原检测主要有胶体金法、酶联免疫法、化学发光法等，通常在15分钟以内就能出诊断结果等优点。然而，这些检测方法也都普遍存在着灵敏度有限，特异性不足，准确率不够等缺点。尤其是准确率方面，抗原检测通常只有60～90％，特别是随着新冠病毒变异株的出现，容易发生漏检错检等误判现象。
3、因此，开发一种基于抗原检测的新方法来克服目前存在的灵敏度不够及准确率不足等缺陷，使得抗原检测真正成为快速简便、灵敏准确、成本低的临床诊断工具，提升其实际应用价值。
技术实现思路
1、本发明的目的就是为了开发一种新检测方法来解决目前抗原检测中存在的灵敏度不够，特异性和准确率不足等问题，在本发明中，设计合成了带有双特异性纳米抗体的dna四面体二聚体结构探针，在协同作用下可同时捕捉目标抗原的两个不同表位，然后与场效应晶体管结合，提供一种基于双纳米抗体dna纳米结构的场效应晶体管传感器的制备方法及检测目标抗原的应用。
2、场效应晶体管传感器是一类极具潜力的分析检测手段，具有低成本、响应快、免标记、无需昂贵检测设备等优点。通过传导和监控带电分子、离子等吸附以及脱附过程中引起半导体沟道导电性发生变化，从而实现痕量物质的检测。再结合超薄半导体敏感材料具有优良导电性和大比表面积等特点，使得基于超薄敏感半导体材料的晶体管传感器的检测灵敏度可达到飞摩尔量级，在生物大分子(抗原，核酸等)、小分子、细胞、病原体、气体和金属离子等检测方面具有重大应用价值。
3、然而传统的场效应晶体管传感器用于目标抗原检测时，大多使用的是单克隆抗体探针。一方面，单克隆抗体生产制造过程往往耗时长(3～6个月)而又昂贵，无法满足大规模生产使用的需求；另一方面，单克隆抗体的体积较大，容易对晶体管传感界面造成堵塞，造成结合速率的降低和影响信号转导。为了解决上述问题，本发明优选使用了筛选出来的具有较强结合亲和力的纳米抗体，生产制造过程较快，成本也低，也解决了体积过大的问题；同时，结合结构dna纳米技术，设计合成了两个四面体连接的二聚体结构，并在每个四面体顶端嫁接有一个纳米抗体，两个纳米抗体的协同作用可以进一步加大结合亲和力以及捕获目标核抗原速度和效率。
4、目标抗原具有多个不同表位，本文明开发的双纳米抗体dna纳米结构可分别靶向其中的两个表位，具有较强的结合亲和力，其中所结合的两个表位间距离固定，因此也决定了双纳米抗体间的距离。由于单个结合位点被抗体捕获后，抗原可能会从松散的抗原-抗体复合物中逸出，故精准的多表位识别有利于增强抗原蛋白的识别效率，进而提高了抗原检测的灵敏度和准确率。
5、本发明开发了一种基于双特异性纳米抗体的dna四面体二聚体结构探针，与传统的抗原检测方法相比，探针结合亲和力提高，操作快速简便，检测结果灵敏准确，具有良好的实际应用价值。
6、本发明的目的通过以下技术方案实现：
7、一种场效应晶体管传感器，所述场效应晶体管传感器包括：绝缘衬底，源漏电极，连接源漏电极的超薄半导体材料层，其中，超薄半导体材料层的半导体材料表面修饰有含有双纳米抗体的dna纳米结构。
8、优选地，所用的电极选自金、银、铜、铬、镍、钛、铁、铝等金属材料中的一种或几种的组合。
9、优选地，所用的超薄半导体材料包括有石墨烯基相关材料、过渡金属化合物材料，有机半导体材料以及mxene材料。厚度为0.34～20纳米。
10、优选地，所述的dna纳米结构为dna四面体二聚体结构，由预先设计的两个dna四面体通过延长链间的碱基互补配对而成。
11、dna四面体二聚体结构的具体合成过程为：
12、制备单个dna四面体结构，即dna四面体-1和dna四面体-2，由4条等浓度的单链dna在pcr仪器中自组装合成得到；
13、制备dna四面体二聚体结构，将得到的dna四面体-1和dna四面体-2以等摩尔比混合均匀，放入pcr仪器经碱基互补配对原则形成二聚体，之后将样品取出，在15～25摄氏度的恒温摇床孵育过夜，即得到dna四面体二聚体结构。
14、优选地，dna四面体二聚体结构是由两个预先设计合成的dna四面体通过底部棱角伸出的延长链互补配对而连接形成二聚体结构，其制备过程包括以下两个步骤：
15、(1)制备单个dna四面体，即dna四面体-1和dna四面体-2，每个dna四面体设计有三个部分，包括有dna四面体骨架，底端两条棱伸出的延长链以及顶端伸出的延长链，根据所测试的目标抗原不同靶向表位间的距离，设计单个四面体大小高度以及延长链碱基个数，延长链的距离由所测目标抗原靶向表位间的距离决定，而顶端伸出的延长链碱基个数为15～25个，用于后续通过互补配对连接纳米抗体-单链dna复合物，每个四面体为通过碱基互补配对而合理设计的4条单链dna以等浓度条件混合，并在pcr仪器中自组装合成；具体过程为：将4条等浓度的单链dna加入缓冲液中置于pcr仪器中，在95摄氏度下循环反应，然后迅速冷却至0～10摄氏度，即得到浓度确定的单个dna四面体结构，后置于低温冰箱保存待用；
16、(2)制备dna四面体二聚体结构：将合成的带有特定碱基个数的单个dna四面体-1和dna四面体-2以等摩尔比混合均匀，后放入pcr仪器中于35～40摄氏度保持5～10分钟，之后缓慢降至10～15摄氏度；之后将样品取出，在15～25摄氏度的恒温摇床孵育，即得到dna四面体二聚体结构。
17、优选地，所设计合成的含有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构中，每个dna四面体上分别带有靶向目标抗原不同表位的纳米抗体-1和纳米抗体-2，为通过多重筛选所得的结合力强特异性高的抗体。
18、含有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构的具体制备过程为：使用spdp分子作为连接分子以及使用超速离心方法经过纯化和浓缩过程，得到纳米抗体-1+spdp+sh-t1-l1和纳米抗体-2+spdp+sh-t2-l2复合物；使用pcr仪和恒温摇床通过碱基互补配对原则合成带有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构。
19、优选地，带有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构复合物的制备过程包括如下：
20、(1)先制备纳米抗体-1+spdp+sh-t1-l1结构和纳米抗体-2+spdp+sh-t2-l2结构，其中，sh-t1-l1及sh-t1-l2是两段在5'端标记有巯基的单链dna，且可以与dna四面体二聚体结构顶端互补配对，碱基个数为15～25，而spdp分子为3-(2-吡啶二巯基)丙酸n-羟基琥珀酰亚胺酯，是一种异-双官能试剂，用于连接巯基标记的单链dna以及特异性纳米抗体；具体过程为：先将纳米抗体与spdp分子以特定摩尔比混合，spdp分子需过量，后置于10～15摄氏度摇床恒温孵育3～5小时，抗体中的氨基可以与spdp发生化学反应；然后使用超速离心方法将多余的未结合的spdp分子滤出；然后将其与单链dna按照一定摩尔比混合，单链dna过量，后置于10～15摄氏度摇床恒温孵育3～5小时；spdp分子可以与单链dna中的巯基反应进一步形成纳米抗体-spdp-单链dna的复合物；最后再使用超速离心方法纯化和浓缩，得到纳米抗体-1+spdp+sh-t1-l1和纳米抗体-2+spdp+sh-t2-l2复合物；
21、(2)纳米抗体-1+spdp+sh-t1-l1复合物和纳米抗体-1+spdp+sh-t2-l2复合物与dna四面体二聚体结构的合成：将上一步中得到的两种复合物等摩尔比混合，然后加入预先合成好的dna四面体二聚体，纳米抗体复合物的浓度是dna四面体二聚体浓度的2倍以上，然后置于pcr仪器中，其中dna四面体二聚体顶端延长链与纳米抗体+spdp+sh-t1复合物通过碱基互补配对合成带有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构。然后置于低温环境中保存待用。
22、本发明还提供所述场效应晶体管传感器的制备方法，包括以下具体制备步骤：
23、(1)在绝缘衬底加工制备源漏电极，且有超薄半导体材料连接源极和漏极，得到场效应晶体管器件；
24、(2)将连接分子修饰到超薄半导体材料表面；
25、(3)通过连接分子将含有纳米抗体双探针的dna纳米结构锚定到半导体材料表面；
26、(4)在器件的沟道上方放置样品池，并加入空白对照液保存待用，得到沟道半导体界面暴露在待测溶液环境中的晶体管传感器件。
27、优选地，其制备方法步骤(3)所述的连接分子是能与超薄半导体材料材料产生化学反应、非共价作用以及吸附作用的双官能团试剂，包括可以通过π-π相互作用、缩合反应或金-硫键作用而连接到半导体上的分子。
28、优选地，步骤(4)所述的场效应晶体管传感器不使用时，在样品池中加入空白对照液并置于低温环境中保存。
29、本发明还提供所述场效应晶体管传感器用于目标抗原检测的应用，在使用该传感器检测时，先将空白对照液加入传感器样品池中，连接电学测试设备，然后测试加入目标抗原溶液后的晶体管器件电信号响应，则可以实现目标抗原的痕量检测。
30、进一步地，测试目标抗原的具体步骤为：
31、(1)将场效应晶体管器件的源漏电极与电学测试系统正负极连接，并保证处于导通状态；
32、(2)往样品池中加入一定量的空白对照液；
33、(3)使用参比电极、玻碳电极、铂电极以及器件本身的栅极给测试系统施加栅极电压；
34、(4)然后选择电学测试系统中的源漏电流(ids)随栅极电压(vg)变化的测试模式(转移曲线模式)，首先设置特定的源漏电压(vds)以及栅极电压变化范围，当传感器件的阈值电压或者狄拉克点电压几乎不变时，即可开始往储液槽中加入目标抗原溶液进行测试；也可以选择电学测试系统中的源漏电流随时间(t)变化的测试模式(直流曲线模式)，给固定的源漏电压和栅极电压，并观察ids的实时变化，当传感器件的源漏电流趋于平稳时，即可开始往储液槽中加入目标抗原溶液进行测试；
35、(5)测试目标抗原溶液时，先从样品池中抽取一定量的空白对照液，再加入相同体积的目标抗原溶液，连接在超薄半导体材料界面的双特异性纳米抗体探针的dna四面体二聚体结构通过抗体-抗原结合反应捕获到目标抗原，该反应过程引发的电荷转移可以使得传感界面的二维半导体材料的导电性发生变化，再结合场效应晶体管器件的电学信号增益放大效果达到检测的目的；
36、(6)采用转移曲线模式测试不同浓度梯度目标抗原溶液的响应时，需要在加入目标抗原溶液后孵育5～15分钟，待其充分反应后再测试，然后读取阈值电压或者狄拉克点电压的变化值作为响应信号；采用直流曲线模式测试不同浓度梯度目标抗原溶液的响应时，在加入目标抗原溶液后，器件的源漏电流会发生即时的变化，待源漏电流再一次趋于平稳时，即可加入更高浓度的目标抗原溶液，最后读取每一个浓度引起的源漏电流变化值作为响应信号，实现待测目标抗原的高灵敏性高特异性检测。而当加入非目标抗原或阴性样本溶液时，双纳米抗体dna四面体二聚体结构不能识别到，因此沟道内的半导体材料界面的阈值电压或者狄拉克点电压几乎不变或者变化很小；直流曲线测试模式下的传感表面半导体导电性几乎不变，进而电流变化值很小。因此，在测试未知样本时，电压变化值或电流变化值大于加入空白对照液后变化值的三倍作为判断阳性的标准。
37、本文明公开的基于双纳米抗体dna纳米结构的场效应晶体管传感器及其制备方法与用于检测目标抗原的应用，得益于双特异性纳米探针的高结合亲和力、特异性以及协同作用，使得探针更有效地识别目标抗原，并且不易解离，同时可以避免免疫逃逸。进而使得传感器检测灵敏度和特异性提升。另外，得益于底座双四面体间的有序可控修饰策略，避免了探针的随机修饰，解决了探针易失活问题；同时，双四面体间距可控，由特异性纳米抗体结合目标抗原的表位距离决定，并同时靶向目标抗原，该探针结构设计原理新颖独特，结合亲和力强，底座四面体也避免了探针间的相互干扰而失活。因此，本文明公开的基于双特异性纳米抗体的场效应晶体管传感器及其制备方法与用于检测目标抗原的应用获得了高灵敏性、高特异性，解决了抗原检测中目前存在的灵敏度不够及准确率不足等问题。
38、本文明的基于双纳米抗体dna纳米结构的场效应晶体管传感器，是一种将化学识别信号转换为电信号的传感装置。结合超薄半导体材料优良导电性，通过传导和监控带电分子、离子等吸附以及脱附过程中引起半导体沟道导电性发生变化，从而实现痕量物质的检测。
39、与传统的抗原检测方法相比，本发明的创新之处在于：使用了优选的具有较强结合亲和力的纳米抗体，生产制造过程快，成本低；同时，结合结构dna纳米技术，设计合成了两个四面体连接的二聚体结构，并在每个四面体顶端嫁接有一个纳米抗体，两个纳米抗体的协同作用可以进一步加大结合亲和力以及捕获目标抗原速度和效率。因此克服了抗原检测中目前存在的灵敏度不够及准确率不足等缺陷。
40、其检测原理为：双纳米抗体dna四面体二聚体结构通过抗体-抗原结合反应捕获到目标抗原，该反应过程引发的电荷转移引发界面半导体材料的电导率发生变化，再经场效应晶体管器件的信号增益放大效果实现实时检测。具有成本低、操作简便、免标记、灵敏度高、准确率高、响应时间短等优点。检测目标抗原时，检测时间低于5分钟，最低检测浓度为5×10-20摩尔/升，得益于双特异性纳米抗体的高识别效率和超灵敏检测。
1.一种场效应晶体管传感器，其特征在于，所述场效应晶体管传感器包括：绝缘衬底，源漏电极，连接源漏电极的超薄半导体材料层，以及修饰在超薄半导体材料表面的含有纳米抗体双探针的dna纳米结构。
2.根据权利要求1所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，所述的绝缘衬底为二氧化硅/硅基底；所述电极选自金、银、铜、铬、镍、钛、铁或铝中的一种或几种的组合。
3.根据权利要求1所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，所述的超薄半导体材料包括有石墨烯基材料、过渡金属化合物材料、有机半导体材料及mxene材料，厚度为0.34～20纳米。
4.根据权利要求1所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，所述的dna纳米结构为dna四面体二聚体结构，由预先设计的两个dna四面体通过延长链间的碱基互补配对而成；
5.根据权利要求4所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，含纳米抗体双探针的dna纳米结构为含纳米抗体双探针的dna四面体二聚体，
6.根据权利要求4所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，含有双纳米抗体的dna四面体二聚体结构中，每个dna四面体上分别带有靶向目标抗原不同表位的纳米抗体-1和纳米抗体-2，为通过多重筛选所得的结合力强特异性高的抗体；
7.根据权利要求6所述的一种场效应晶体管传感器，其特征在于，
8.权利要求1-7中任一项所述的场效应晶体管传感器的制备方法，其特征在于，包括以下具体制备步骤：
9.根据权利要求8所述的场效应晶体管传感器的制备方法，其特征在于，所述的连接分子是能与超薄半导体材料材料产生化学反应、非共价作用以及吸附作用的双官能团试剂，包括可以通过π-π相互作用、缩合反应或金-硫键作用而连接到半导体上的分子。
10.权利要求1-7中任一项所述的场效应晶体管传感器用于目标抗原检测的应用，其特征在于，用于目标抗原检测的具体步骤为：
