本发明属于细胞工程，具体涉及一种靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体和应用。
背景技术：
1、嵌合抗原受体(chimeric antigen receptor,car)修饰的t细胞作为一种免疫治疗策略，在肿瘤治疗中受到广泛的重视和应用。car的结构一般由胞外靶向连接区(常为具有抗原识别功能的单链抗体)，铰链区，跨膜区和胞内信号转导区四部分组成。目前根据胞内信号转导区加入共刺激分子的数量，将car分为一代(无共刺激分子)、二代(含一种共刺激分子)和三代(含两种共刺激分子)。目前应用最多的是二代car。
2、b细胞恶性肿瘤如b细胞淋巴细胞白血病(b-all)和淋巴瘤是b淋巴细胞异常克隆性增殖所致的恶性疾病，尽管目前化疗效果显著，但仍有15％的儿童b-all和60％的成人ball患者因对化疗药物耐药而预后不佳；淋巴瘤患者经一线方案治疗后仍有15％复发，这些患者进行造血干细胞移植后，仍有50％最终复发。因此，寻找有效的细胞免疫治疗手段来治疗b细胞恶性肿瘤一直是血液学界研究热点。
3、cd19和cd22是b淋巴细胞表面特有的抗原分子。cd19几乎表达于所有的b-all和淋巴瘤细胞表面，在b系正常造血细胞表面表达，而在正常非造血组织中没有表达。cd22是一种b系分化抗原，表达于b细胞发育的各个阶段，b细胞分化为浆细胞后不再表达cd22；60％～80％的b细胞恶性肿瘤表达cd22，90％以上的弥漫大b细胞淋巴瘤(dlbcls)和滤泡淋巴瘤(fls)为cd22阳性；几乎所有的b前体细胞急性淋巴细胞白血病(b-all)表达cd22；慢性淋巴细胞白血病、毛细胞白血病(hcl)也具有高水平的cd22表达。与cd19抗原相似，cd22同样是b细胞限制性表达，不表达于其他实质细胞，亦不表达于造血干细胞，因此作为b细胞肿瘤抗原的特异性高，已经成为b细胞恶性肿瘤中的主要治疗靶点。
4、目前，尽管cd19-car-t在难治、复发b-all的治疗中取得了较好疗效，但仍有患者在治疗中出现cd19抗原突变或丢失等异常，致使cd19-car-t细胞不能识别及杀伤b-all细胞，导致疾病复发。cd22与cd19在肿瘤细胞表面具有广泛的共表达，且在cd19抗原丢失后cd22仍然保留。但相对cd19抗原，cd22抗原属于低峰度抗原，因此，开发一种新的cd22抗体，应用于cd19、cd22双靶点的car-t细胞中，成为一个技术难点。
技术实现思路
1、本发明提供了一种具有很好抗肿瘤效果的可同时靶向cd19和cd22的嵌合抗原受体。
2、具体的，所述嵌合抗原受体包含胞外结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号域，具体结构为以下结构中的一种：
3、(1)cd22 scfv-linker-cd19 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbz(1)
4、(2)cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)-2a-cd22 scfv-8h(3)-28tm-28z。
5、(3)cd19 scfv-linker-cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbz(1)
6、(4)cd22 scfv-linker-cd19 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbhz(1)
7、(5)cd19 scfv-linker-cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbhz(1)
8、(6)cd19 scfv-linker-cd22 scfv-8h(3)-28tm-28z
9、(7)cd22 scfv-linker-cd19 scfv-8h(3)-28tm-28z
10、(8)cd22 scfv-8h(3)-28tm-28z-2a-cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)
11、(9)cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)-2a-cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbz(1)
12、(10)cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)-2a-cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbhz(1)
13、(11)cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbz(1)-2a-cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)
14、(12)cd22 scfv-8h(1)-8tm(1)-bbhz(1)-2a-cd19 scfv-8h(2)-8tm(2)-bbz(2)
15、进一步的，所述cd22 scfv包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；所述l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3分别为如下序列：qsvssnl、gas、qqyhswpplt；所述h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3分别为如下序列：gytftsyg、isayngnt、ardfqgiavadldy或其突变序列ardfqgiaeadldy。
16、进一步的，所述cd22 scfv包含如sequence no.1、sequence no.2或sequenceno.3所示的氨基酸序列或其功能性变体。
17、进一步的，所述cd19 scfv包含如sequence no.4或sequence no.5所示的氨基酸序列或其功能性变体。
18、进一步的，所述8h(1)与8h(2)包含如sequence no.6所示的氨基酸序列或其功能性变体。
19、进一步的，所述8tm(1)与8tm(2)包含如sequence no.7所示的氨基酸序列或其功能性变体。
20、进一步的，所示bbz(1)与bbz(2)中的bb包含如sequence no.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述bbz(1)与bbz(2)中的z包含如sequence no.9所示的氨基酸序列或其功能性变体。
21、进一步的，所述linker包含如sequence no.10所示的氨基酸序列或其功能性变体。
22、进一步的，所述8h(3)包含如sequence no.11所示的氨基酸序列或其功能性变体。
23、进一步的，所述28tm包含如sequence no.12所示的氨基酸序列或其功能性变体。
24、进一步的，所述28z中的28包含如sequence no.13所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述28z中的z包含如sequence no.14所示的氨基酸序列或其功能性变体。
25、进一步的，所述结构(1)与(2)中的最前面包含信号肽，所述信号肽为cd8a，所述cd8a包含如sequence no.15所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述2a包含如sequenceno.16所示的氨基酸序列或其功能性变体。
26、本发明提供一种核酸分子，所述核酸分子编码上述任意一种嵌合抗原受体，其核酸序列包含如sequence no.17、sequence no.18、sequence no.19、sequence no.20、sequence no.21、sequence no.22、sequence no.23所示的序列。
27、本发明还提供一种表达载体，所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、dna载体，rna载体、质粒中的任一种，所述表达载体包含如上所述的任意一种核酸分子。
28、本发明还提供一种工程化细胞，所述细胞中转导有如上所述的核酸分子或如上所述的表达载体。
29、进一步的，所述细胞为t细胞、t细胞前体或nk细胞。
30、如上所述任意一项所述的嵌合抗原受体或如上所述的核酸分子或如上所述的表达载体或如上所述的工程化细胞或如上所述的细胞制品在制备抗肿瘤药物中的应用。
31、进一步的，所述抗肿瘤药物为抗急性淋巴样白血病药物、抗慢性淋巴细胞白血病药物、抗慢性髓性白血病药物、抗非霍奇金淋巴瘤药物、抗霍奇金淋巴瘤药物、抗前列腺癌药物、抗结直肠癌药物、抗乳腺癌药物、抗卵巢癌药物、抗宫颈癌药物、抗胰腺癌药物、抗肺癌药物、抗肾癌药物、抗肝癌药物、抗脑癌药物或抗皮肤癌药物。
32、本发明中，术语“功能性变体”通常是指包括与其具有基本上相同的功能(例如，可以具备所述嵌合抗原受体的性质)，且与其具有至少85％(例如，至少85％，至少90％，至少91％，至少92％，至少93％，至少94％，至少95％，至少96％，至少97％，至少98％，至少99％，或至少100％)序列同一性的氨基酸序列。在某些实施方式中，所述氨基酸序列的变体为与其具有基本上相同的功能。
33、本发明中，“bb”为胞内信号域cd137的简写，z为胞内信号域cd3ζ的简写，8h为铰链区为cd8a的简写，8tm为跨膜区为cd8a的简写，28z为胞内信号域为cd28和cd3ζ的简写。
34、本发明中的cd22序列可以与现有的所有公开的cd19scfv一起构建双靶点的嵌合抗原受体，或者也可以跟其他靶点序列一起构建双靶点的嵌合抗原受体。
35、本发明中的细胞制品还包括其他可增强car表达活性的活性剂。
36、在某些具体实施例中，所述活性剂为免疫抑制剂，例如环孢素(cyclosporin)、硫唑嘌呤(azathioprine)、甲氨蝶呤(methotrexate)、霉酚酸酯(mycophenolate)和fk506、抗体或其它免疫清除剂(immunoablativeagents)例如campath、抗cd3抗体或其它抗体治疗、环磷酰胺(5ytoxan)、氟达拉滨(fludarabine)、环孢素(cyclosporin)、fk506、雷帕霉素(rapamycin)、霉酚酸(mycophenolicacid)、类固醇(steroids)、fr901228、细胞因子和辐射。
37、在某些具体实施例中，增强car表达细胞活性的活性剂可以是阻断抑制性分子的活性剂。抑制性分子如pd1可以在一些实施方案中降低car表达细胞发动免疫效应子反应的能力。抑制性分子包括pd1、pd-l1、ctla4、tim3、lag3、vista、btla、tigit,lair1、cd160、2b4、ceacam(ceacam-1、ceacam-3、ceacam-5)、lag3、vista、btla、tig、lair1、cd160、2b4、cd80、cd86、b7-h3(cd276)、b7-h4(vtcn1)、hvem(tnfrsf14或cd270)、kir、a2ar、mhc i类、mhc ii类、gal9、腺苷、tgfr(tgfrβ)和tgfrβ。所述抑制性分子的胞外结构域可以融合到跨膜结构域和胞内信号传导结构域，比如pd1 car。在某些具体实施例中，增强car表达细胞活性的活性剂还可以是细胞因子受体趋化因子受体的活性剂。细胞因子受体可衍生自i型细胞因子受体，例如il-2、il-4、il-7、il-9、il-13、il-15或il-21。
38、进一步，多种另外的治疗剂可以与本文所述的组合物联合使用。例如，潜在有用的另外的治疗剂包括pd-1抑制剂，例如纳武单抗(nivolumab)派姆单抗(pembrolizumab)派姆单抗、阿巴伏单抗(pidilizumab)和阿特珠单抗(atezolizumab)。
39、具体地，适合于与本发明组合使用的另外的治疗剂包括但不限于伊布替尼(ibrutinib)奥法木单抗(ofatumumab)利妥昔单抗(rituximab)贝伐单抗(bevacizumab)曲妥珠单抗(trastuzumab)trastuzumabemtansine伊马替尼(imatinib)西妥昔单抗(cetuximab)帕尼单抗(panitumumab)卡妥索单抗(catumaxomab)、替伊莫单抗(ibritumomab)、奥法木单抗、托西莫单抗(tositumomab)、本妥昔单抗(brentuximab)、阿仑单抗(alemtuzumab)、吉妥珠单抗(gemtuzumab)、厄洛替尼(erlotinib)、吉非替尼(gefitinib)、凡德他尼(vandetanib)、阿法替尼afatinib)、拉帕替尼(lapatinib)、来那替尼(neratinib)、阿昔替尼(axitinib)、马赛替尼(masitinib)、帕唑帕尼(pazopanib)、舒尼替尼(sunitinib)、索拉非尼(sorafenib)、toceranib、来他替尼(lestaurtinib)、阿昔替尼(axitinib)、西地尼布(cediranib)、乐伐替尼(lenvatinib)、尼达尼布(nintedanib)、帕唑帕尼(pazopanib)、瑞格非尼(regorafenib)、司马沙尼(semaxanib)、索拉非尼(sorafenib)、舒尼替尼(sunitinib)、tivozanib、toceranib、凡德他尼、恩曲替尼(entrectinib)、卡博替尼(cabozantinib)、伊马替尼(imatinib)、达沙替尼(dasatinib)、尼洛替尼(nilotinib)、帕纳替尼(ponatinib)、雷多替尼(radotinib)、博舒替尼(bosutinib)、来他替尼(lestaurtinib)、鲁索替尼(ruxolitinib)、pacritinib、考比替尼(cobimetinib)、司美替尼(selumetinib)、曲美替尼(trametinib)、binimetinib、阿雷替尼(alectinib)、色瑞替尼(ceritinib)、克唑替尼(crizotinib)、阿柏西普(aflibercept)、adipotide、地尼白介素。
40、进一步，所述细胞制品还可以与一些治疗手段组合使用，所述治疗手段可以是手术、化疗、放射。
41、“表达载体”是指包含重组多核苷酸的载体，该重组多核苷酸包含与待表达的核酸序列有效地连接的表达控制序列。表达载体包含足够的用于表达的顺式作用元件；用于表达的其他元件可以由宿主细胞提供或在体外表达系统中提供。表达载体包括本领域已知的所有表达载体，包括掺入重组多核苷酸的粘粒、质粒(例如，裸露的或包含在脂质体中)和病毒(例如，慢病毒、逆转录病毒、腺病毒和腺相关病毒)。
42、“慢病毒”是指逆转录病毒科的一个属。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，能够感染非分裂细胞；它们可以将显著量的遗传信息递送到宿主细胞的dna中，因此它们是基因递送载体的最有效方法中的一种。hiv、siv、和fiv都是慢病毒的实例。
43、已经开发了许多基于病毒的系统用于将基因转移到哺乳动物细胞中。例如，逆转录病毒为基因递送系统提供了便利的平台。可以使用本领域已知的技术将选择的基因插入到载体中并且包装在逆转录病毒颗粒中。然后可以分离重组病毒并在体内或离体递送至受试者的细胞中。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施例中，使用了腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施例中，使用慢病毒载体。
44、用于将多核苷酸引入到宿主细胞中的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染、粒子轰击、显微注射、电穿孔等。产生包含载体和/或外源性核酸的细胞的方法在本领域中是熟知的。参见例如，sambrook等人,2012,molecular cloning:a laboratory manual[分子克隆实用指南],第1-4卷,cold spring harbor press[冷泉港实验出版社],纽约)。将多核苷酸引入到宿主细胞中的优选方法是磷酸钙转染。
45、现有技术中，制备基因修饰免疫细胞的方案包括如下步骤中的至少一步：①取血样，②富集，③分选，④活化，⑤转染，⑥再次富集。
46、某些实施例中，所采用的car-t制备方法为快速制备方法，步骤如下：1、外周血核细胞分离：采集的全血或单采有核细胞，可进行冷冻；2、外周血核细胞活化0-27h：分离得到的或者复苏后的单个核细胞采用免疫磁珠分选得到t淋巴细胞或nk细胞，可进行冷冻；具体的，分选后的t淋巴细胞或nk细胞或者复苏后的t淋巴细胞或nk细胞，与复合物的抗体(可含磁珠)或小分子和/或刺激细胞表面上的共刺激分子的抗体(可含磁珠)接触；3、转染0-72h：t淋巴细胞或nk细胞与慢病毒载体接触；4、富集14-72h：收集最后获得的car-t/car-nk细胞。
47、在上述快速制备的任何一个环节中都可以使用密度梯度离心，采用的溶液为比重为1.077±0.001的聚蔗糖-泛影葡胺，并且离心步骤中的重悬液和洗涤液都可以为维持细胞渗透压的缓冲液，比如含na离子(如生理盐水或含有0.5wt％～2wt％hsa的生理盐水)或k离子(如kcl溶液或者含有0.5wt％～2wt％hsa的kcl水溶液)或含蛋白成分(如不同浓度的人血白蛋白、不同浓度的人自体血浆)。
48、本发明有益效果在于
49、(1)本发明的目的是针对现有技术中cd19car-t治疗期间因b-all的逃避机制等而产生复发或无效，提供了一种同时靶向cd22和cd19的双靶点嵌合抗原受体，其中的cd22scfv是经过突变的，是对人cd22抗原具有更高亲和力的全人源化抗体。
50、(2)本发明提供的靶向cd22和cd19的嵌合抗原受体克服了现有技术中双靶点car的技术效果缺陷，降低car-t治疗后肿瘤复发率，且car转导效率高，适合工业化生产，经试验验证可同时靶向cd19和cd22的双特异性位点的car-t细胞具有很好的抗肿瘤效果。
1.cd22的scfv，其特征在于：所述cd22的scfv包含重链可变区和轻链可变区，所述轻链可变区包含l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3，所述重链可变区包含h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3；所述l-cdr1、l-cdr2和l-cdr3分别为如下序列：qsvssnl、gas、qqyhswpplt；所述h-cdr1、h-cdr2和h-cdr3分别为如下序列：gytftsyg、isayngnt、ardfqgiavadldy或其突变序列ardfqgiaeadldy。
2.如权利要求1所述的cd22的scfv，其特征在于：所述cd22的scfv包含如sequenceno.1、sequence no.2或sequence no.3所示的氨基酸序列或其功能性变体。
3.一种双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体包括权利要求1或2所述的cd22的scfv。
4.如权利要求3所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述双靶点嵌合抗原受体另一个靶点为cd19，所述cd19 scfv包含如sequence no.4或sequence no.5所示的氨基酸序列或其功能性变体。
5.如权利要求3或4所述的双靶点嵌合抗原受体，其特征在于：所述嵌合抗原受体包含胞外结构域、铰链区、跨膜区和胞内信号域，所述嵌合抗原受体包括如权利要求1或2任意一项所述的scfv，具体结构为以下结构中的一种：
6.如权利要求5所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述8h(1)与8h(2)包含如sequenceno.6所示的氨基酸序列或其功能性变体。
7.如权利要求6所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述8tm(1)与8tm(2)包含如sequence no.7所示的氨基酸序列或其功能性变体。
8.如权利要求7所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所示bbz(1)与bbz(2)中的bb包含如sequence no.8所示的氨基酸序列或其功能性变体，所述bbz(1)与bbz(2)中的z包含如sequence no.9所示的氨基酸序列或其功能性变体。
9.如权利要求8所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述linker包含如sequence no.10所示的氨基酸序列或其功能性变体。
10.如权利要求9所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述8h(3)包含如sequence no.11所示的氨基酸序列或其功能性变体。
11.如权利要求10任意一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述28tm包含如sequence no.12所示的氨基酸序列或其功能性变体。
12.如权利要求11任意一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述28z中的28包含如sequence no.13所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述28z中的z包含如sequence no.14所示的氨基酸序列或其功能性变体。
13.如权利要求3-12任意一项所述的嵌合抗原受体，其特征在于：所述结构(1)与(2)中的最前面包含信号肽，所述信号肽为cd8a，所述cd8a包含如sequence no.15所示的氨基酸序列或其功能性变体；所述2a包含如sequence no.16所示的氨基酸序列或其功能性变体。
14.一种核酸分子，其特征在于，编码权利要求3-13任意一项所述的嵌合抗原受体，其核酸序列包含如sequence no.17、sequence no.18、sequence no.19、sequence no.20、sequence no.21、sequence no.22、sequence no.23所示的序列。
15.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包含如权利要求14所述的核酸分子。
16.如权利要求15所述的表达载体，其特征在于：所述表达载体选自慢病毒表达载体、逆转录病毒表达载体、腺病毒表达载体、dna载体，rna载体、质粒中的任一种。
17.一种工程化细胞，其特征在于：所述细胞中转导有权利要求14所述的核酸分子或权利要求15或16所述的表达载体；优选地，所述细胞为t细胞、t细胞前体或nk细胞。
18.一种细胞制品，其特征在于；所述细胞制品包括如权利要求17所述的工程化细胞。
19.权利要求3-13任意一项所述的嵌合抗原受体或权利要求14所述的核酸分子或权利要求15或16所述的表达载体或权利要求17所述的工程化细胞或权利要求18所述的细胞制品在制备抗肿瘤药物中的应用，优选的，所述抗肿瘤药物为抗急性淋巴样白血病药物、抗慢性淋巴细胞白血病药物、抗慢性髓性白血病药物、抗非霍奇金淋巴瘤药物、抗霍奇金淋巴瘤药物、抗前列腺癌药物、抗结直肠癌药物、抗乳腺癌药物、抗卵巢癌药物、抗宫颈癌药物、抗胰腺癌药物、抗肺癌药物、抗肾癌药物、抗肝癌药物、抗脑癌药物或抗皮肤癌药物。
