本发明属于生物研究实验，尤其涉及一种鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器及其使用方法。
背景技术：
1、鳞翅目是昆虫纲中数量仅次于鞘翅目的第二大目昆虫，约有20多万种，广泛分布于世界各地，中国已知约有8000余种。该类目昆虫绝大多数是重要的农业害虫，体型小者通常以卷叶、吐丝结网或钻入植物组织取食等方式为害作物，体型大者常以食尽叶片、咬断根系或钻蛀枝干为害作物，例如：二化螟、桃蛀螟、甜菜夜蛾、棉铃虫等。另一方面，鳞翅目昆虫在资源昆虫中也占有极其重要的地位，许多种类一直作为中药材或食物来源为人类所利用，如家蚕、柞蚕、天蛾、蝙蝠蛾、部分蝶类等(牟吉元,徐洪富,荣秀兰.普通昆虫学[m].北京:中国农业出版社,2001:188.)。
2、虹吸式口器是鳞翅目昆虫成虫所特有的口器类型(少数原始蛾类除外)。其显著特点是具有一条能卷曲和伸缩的喙以及一对发达的下唇须。其中，下唇须是鳞翅目昆虫除了触角之外的重要的嗅觉器官(galizia&.2010.parallel olfactory systems ininsects:anatomy and function.annual review of entomology,55:399-420.)。作为鳞翅目昆虫口器中最突出的结构之一，下唇须上通常覆盖大量的鳞片和多种类别一定数量的感器。下唇须第3节具有一个凹陷结构，称为下唇须陷窝器(labial-palp pit organ，lpo)。陷窝器中的感器可以准确感知co2浓度变化，与取食偏好或产卵位点选择等行为密切相关。目前国内外关于鳞翅目昆虫下唇须及陷窝器中感器形态和功能的报道已有很多，如烟草天蛾、灯蛾、仙人掌螟蛾、棉铃虫、粘虫、桃蛀果蛾、梨小食心虫、小菜蛾、宽胫夜蛾等。
3、由于鳞翅目昆虫的嗅觉在该类昆虫寻找配偶和食物、搜寻产卵场所、躲避外界不利环境的伤害等起着非常重要的作用，因此对该类昆虫口器中重要附肢下唇须的形态结构展开深入研究，可为该器官的功能研究、高效防治方法的研发、昆虫分类、资源利用等科研工作提供坚实的理论依据。
4、在采用已报道的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞技术处理样品时笔者发现，普通胶带脱鳞法(2014-董钧锋等.2014.粘虫下唇须陷窝器及其感器的形态、类型与分布.昆虫学报,57(6):681-687)易造成标本挤压变形破损，且单个样品处理耗时较长；曲拉通去垢浸泡液结合超声波清洗处理去除鳞鳞片法(闫喜中等.2019.小菜蛾成虫下唇须感器的超微结构及其神经元中枢投射.昆虫学报,62(2):205-214.)存在一定比例标本破碎，损失率较高问题(预备实验20头，40％损失率)。因此，为了提高显微镜下观察并脱除鳞片的便利性和有效性，保证脱除鳞片后鳞翅目昆虫下唇须标本的完整性，在现有鳞翅目昆虫下唇须鳞片脱除技术的基础上，研发出显微观察中更为简便高效的鳞翅目昆虫下唇须鳞片脱除实验工具及配套技术方法具有非常重要的现实意义。
技术实现思路
1、发明目的：针对现有实验工具和技术方法存在的问题，本发明提供一种鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器及其使用方法，本发明通过在脱鳞器的胶带槽内缠绕胶带，使胶带的涂胶层朝外并覆盖脱鳞台，配合解剖镊子和小毛笔，将试剂预处理后的下唇须标本在脱鳞台上反复轻柔滚动，使鳞片被胶带的涂胶层固定，从昆虫下唇须表面脱除。本发明既保证了在显微镜下观察并脱除鳞片的便利性和有效性，又保证了脱除鳞片后鳞翅目昆虫下唇须标本的完好性，避免了普通胶带脱鳞法易造成的标本挤压变形和耗时较长问题，以及试剂预处理配合超声波脱鳞法易造成的标本破碎问题，因此可以广泛应用于超景深体式显微镜、扫描电子显微镜试验中所需鳞翅目昆虫下唇须标本的鳞片脱除。
2、技术方案：为了实现上述目的，本发明所述一种鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，包括手柄、胶带槽、固定卡扣和脱鳞台；所述脱鳞台位于脱鳞器的底部，其上设置有胶带槽和固定卡扣，所述手柄位于脱鳞器顶部的一侧。
3、其中，所述手柄位于脱鳞器顶部的一侧，宽度为0.3-1cm，高度为5-10cm，厚度0.3-1.5cm，用于下唇须标本的移动。
4、其中，所述脱鳞台位于脱鳞器底部，为正方形或长方形平台，为显微镜下观察并脱除下唇须表面鳞片的操作平台。
5、其中，所述正方形平台宽度和高度为1-6cm，厚度0.3-1.5cm；所述长方形平台宽度为1-3cm，高度为2-6cm，厚度0.3-1.5cm。
6、其中，所述胶带槽和固定卡扣位于脱鳞器的中部，用于固定脱除鳞片所需的胶带；所述胶带槽为宽度1-5cm，深度0.3-1.5cm，厚度0.3-1.5cm的凹槽结构；所述固定卡扣为宽度0.3-1.5cm，高度0.3-1.5cm，厚度0.3-1.5cm的凸起结构。
7、其中，所述手柄、胶带槽、固定卡扣和脱鳞台均采用透明亚克力材料制成。
8、本发明所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器的使用方法，包括以下步骤：
9、(a)鳞翅目昆虫下唇须样品预处理：包括去垢浸泡液浸泡、卡诺氏固定液一次固定、戊二醛固定液二次固定、磷酸缓冲液漂洗、乙醇梯度脱水、无水乙醇保存液浸泡；
10、(b)将鳞翅目昆虫头部样品从步骤(a)所述无水乙醇保存液中取出，置于滤纸片上，待自然风干后，用解剖镊子将下唇须自着生位置的基部取下得到完整的下唇须样品；
11、(c)通过在脱鳞器的脱鳞台上胶带槽内缠绕透明胶带，使胶带的涂胶层朝外并覆盖脱鳞台，并通过固定卡扣固定胶带；
12、(d)将解剖所得完整的下唇须样品置于已缠绕透明胶带的脱鳞台上，持手柄将样品移动至普通解剖镜或超景深体式显微镜下观察，配合解剖镊子和小毛笔，将下唇须样品在脱鳞台上反复轻柔滚动，使鳞片被胶带的涂胶层固定，从昆虫下唇须骨化的附肢表面脱除。
13、其中，步骤(a)鳞翅目昆虫下唇须样品预处理，具体包括以下6个步骤：
14、(a)取待测鳞翅目昆虫活体成虫30-50头，取下头部，至于盛有去垢浸泡液的离心管中，低温保存；
15、(b)除去步骤(a)所述离心管中所有去垢浸泡液，随后立即加入卡诺氏固定液，于低温中存放，作为该批次昆虫样品的第一次固定；
16、(c)除去步骤(b)所述离心管中所有卡诺氏固定液，随后立即加入戊二醛固定液，低温保存，作为该批次昆虫样品的第二次固定；
17、(d)除去步骤(c)所述离心管中所有戊二醛固定液，随后立即加入磷酸缓冲液进行震荡漂洗，除去漂洗液，进行多次重复漂洗步骤；
18、(e)除去步骤(d)所述离心管中所有磷酸缓冲液漂洗液，用70-100％乙醇溶液进行梯度脱水；梯度脱水后继续用无水乙醇脱水；
19、(f)除去步骤(e)所述离心管中所有乙醇溶液，随后立即加入无水乙醇保存液，用于该批次标本的长期保存。
20、作为优选，步骤(a)鳞翅目昆虫下唇须样品预处理，具体包括以下6个步骤：
21、(a)取待测鳞翅目昆虫活体成虫30-50头，用眼科手术剪刀取下头部，至于盛有去垢浸泡液的50ml离心管中，于4℃冰箱保存12-24h；去垢浸泡液为60-90％乙醇配制的含有0.5-5％ triton x-100(表面活性剂曲拉通)溶液，所需容积为10-30ml。
22、(b)用移液枪除去步骤(a)所述离心管中所有去垢浸泡液，随后立即加入10-30ml卡诺氏固定液(体积比为无水乙醇：冰醋酸＝3：1)，于4℃冰箱中存放12h，作为该批次昆虫样品的第一次固定；
23、(c)用移液枪除去步骤(b)所述离心管中所有卡诺氏固定液，随后立即加入10-30ml的1-25％戊二醛固定液(由ph 7.2磷酸缓冲液配制，于4℃冰箱中预冷)，于4℃冰箱中保存12-24h，作为该批次昆虫样品的第二次固定；
24、(d)用移液枪除去步骤(c)所述离心管中所有戊二醛固定液，随后立即加入10-30ml体积ph 7.2磷酸缓冲液进行震荡漂洗，震荡漂洗10min后除去漂洗液，重复本步骤漂洗3次。
25、(e)用移液枪除去步骤(d)所述离心管中所有磷酸缓冲液漂洗液，用70％、80％、90％、95％、100％乙醇溶液进行梯度脱水，每次15-30min，溶液用量为10-30ml；紧接着用100％乙醇脱水两次，每次15-30min，溶液用量为10-30ml。
26、(f)用移液枪除去步骤(e)所述离心管中所有梯度脱水用100％乙醇溶液，随后立即加入10-30ml无水乙醇保存液，用于该批次标本的长期保存。
27、其中，步骤(c)中在脱鳞器的脱鳞台上胶带槽内缠绕0.8-4.8cm宽的透明胶带，使胶带的涂胶层朝外并覆盖脱鳞台。
28、进一步地，本发明中使用的胶带为市售0.8-4.8cm透明胶带。作为优选，使用市售0.8-4.8cm得力透明胶带。作为优选，采用市售规格透明胶带为0.8、1.2、1.6或者4.8厘米，通过胶带槽将其卡住，厚度无特定要求。
29、本发明做了很多预实验，但采用已报道的方法都效果欠佳。
30、(1)首先普通胶带法开展预备实验时，仅重复了10头，发现平均耗时约60分钟，甚至更长时间，判断此法效率太低，故直接放弃继续使用普通胶带法。
31、(2)随后采用曲拉通去垢浸泡液和超声波清洗法，一共处理了20头(雌雄各10头)样品，结果在体式显微镜下检测发现仅12头(雌雄各6头)样品勉强可用，其余样品破碎严重无法观察，故放弃继续采用此法。
32、而本发明所述方法，试剂处理后标本不经过超声波，也就避免了较大比例样品破碎损失问题，同时曲拉通去垢的功能也优化了胶带脱除鳞片的效果，缩短了单个样品处理时间。
33、有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下优点：
34、(1)在普通胶带脱鳞法(董钧锋等，2014)实际操作时，需一侧用解剖镊子固定样品，另一侧手持胶带或用镊子包裹胶带进行粘贴，常因胶带按压时力度过大，或因胶带揭开时涂胶层粘黏度过大，造成样品挤压变形破损。与上述方法相比，本发明采用了透明亚克力材质的脱鳞器，搭配使用解剖镊子和小毛笔进行脱除鳞片这一新的实验技术，实验操作时对下唇须表面操作的力度更轻柔且容易控制。而本发明的脱鳞器及其使用方法既保证了在显微镜下观察并脱除鳞片的便利性和有效性，又保证了脱除鳞片后鳞翅目昆虫下唇须标本的完好性，避免了普通胶带脱鳞法容易造成的标本挤压变形破损等问题。此外，由于普通胶带脱鳞法处理单个下唇须耗时至少60分钟甚至更长时间，而本发明的脱鳞器及其使用方法仅需8-15分钟即可完成对单个下唇须的脱鳞处理，因此本发明有效缩短了胶带脱鳞这一步骤所需实验时间。
35、(2)本发明的使用方法在对下唇须标本展开去垢、固定、脱水一系列试剂预处理时，采用了含有非离子性去垢剂曲拉通(triton)的去垢浸泡液。已知1％tritonx-100常用于漂洗组织标本。本发明中该浓度的去垢浸泡液，不仅有效地去除了鳞翅目昆虫下唇须标本表面的污渍，而且使得下唇须表面鳞片更容易被脱鳞器胶带的涂胶层固定，并从骨化的下唇须附肢表面脱落。本发明在预备实验中未加入曲拉通的标本表面因鳞片残留过多，标本效果不佳。
36、(3)与已报道的曲拉通去垢浸泡液和超声波清洗处理后，再进行乙醇梯度脱水的昆虫下唇须样品制作方法(闫喜中等，2019)相比，本发明的脱鳞器和使用方法所得鳞翅目昆虫下唇须鳞片样品形态完好，避免了超声波脱鳞法易造成的较高比例标本破碎损失问题。此外，本发明的脱鳞器脱除鳞片这一新的实验方法，是在普通解剖镜或体式显微镜下进行的，与上文所述试剂和超声波处理法相比，本方法可以快速判断附肢表面鳞片是否已脱除干净。因此，本发明的脱鳞器和使用方法可以广泛应用于超景深体式显微镜、扫描电子显微镜试验中所需鳞翅目昆虫下唇须标本的鳞片脱除。
1.一种鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，包括手柄(1)、胶带槽(2)、固定卡扣(3)和脱鳞台(4)；所述脱鳞台(4)位于脱鳞器的底部，其上设置有胶带槽(2)和固定卡扣(3)，所述手柄(1)位于脱鳞器顶部的一侧。
2.根据权利要求1所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，所述手柄(1)位于脱鳞器顶部的一侧，宽度为0.3-1cm，高度为5-10cm，厚度0.3-1.5cm。
3.根据权利要求1所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，所述脱鳞台(4)位于脱鳞器底部，优选为正方形或长方形平台，为显微镜下观察并脱除下唇须表面鳞片的操作平台。
4.根据权利要求3所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，所述正方形平台宽度和高度为1-6cm，厚度0.3-1.5cm；所述长方形平台宽度为1-3cm，高度为2-6cm，厚度0.3-1.5cm。
5.根据权利要求3所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，所述胶带槽(2)和固定卡扣(3)位于脱鳞器的中部，用于固定脱除鳞片所需的胶带；所述胶带槽为宽度1-5cm，深度0.3-1.5cm，厚度0.3-1.5cm的凹槽结构；所述固定卡扣为宽度0.3-1.5cm，高度0.3-1.5cm，厚度0.3-1.5cm的凸起结构。
6.根据权利要求3所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器，其特征在于，所述手柄(1)、胶带槽(2)、固定卡扣(3)和脱鳞台(4)均采用透明亚克力材料制成。
7.一种权利要求1所述的鳞翅目昆虫下唇须脱鳞器的使用方法，其特征在于，包括以下步骤：
8.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤(a)鳞翅目昆虫下唇须样品预处理，具体包括以下6个步骤：
9.根据权利要求7所述的使用方法，其特征在于，步骤(c)中在脱鳞器的脱鳞台(4)上胶带槽(2)内缠绕0.8-4.8cm宽的透明胶带，使胶带的涂胶层朝外并覆盖脱鳞台(4)。
