本发明涉及基于工程，特别涉及一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31及其构建方法和应用。
背景技术：
1、癌症严重威胁人类生命健康，依旧是亟待解决的生物医学问题。癌症治疗一直是焦点话题，也是医药研发的热门方向，但目前还有能够根治的方法。非小细胞肺癌、胰腺癌、结直肠癌都是恶性程度极高的恶性癌症，发病率和致死率在逐年提升。在临床上，肿瘤细胞区分实体瘤与非实体瘤，传统癌症治疗方法有外科手术、放疗、化疗和药物；新型治疗方法逐渐增多，如靶向基因治疗、免疫治疗。其中免疫治疗主要包括疫苗、免疫检查点抑制剂、溶瘤病毒等。
2、溶瘤病毒(oncolytic virus,ovs)是一类对肿瘤细胞高度敏感的特殊病毒，其对正常的细胞杀伤性较小。溶瘤病毒可以靶向地识别、感染肿瘤细胞，在肿瘤细胞内复制，最终致使肿瘤细胞死亡。肿瘤细胞裂解死亡，有利于放病原体相关分子(pathogen-associated molecular pattern molecules，pamp)、肿瘤抗原(tumor-associatedantigen，taa)等释放，能够引起体内的抗肿瘤免疫反应，引导免疫系统对其他癌细胞甚至远端病灶展开攻击。
3、在溶瘤病毒疗法中，病毒载体又分为天然溶瘤病毒、基因改造溶瘤病毒两种。基因改造溶瘤病毒有以下几种：腺病毒(adenovirus)、单纯疱疹病毒(hsv)、痘苗病毒(vacciniavirus)等。溶瘤腺病毒是一种能够特异性靶向肿瘤细胞的病毒，也是目前肿瘤靶向基因治疗常用到的病毒载体。
4、腺病毒是一种没有包膜，内含双链dna病毒，直径大小为70～90nm，目前研究较多的是2型和5型腺病毒。将腺病毒作为基因治疗的载体，构建肿瘤特异性启动子启动溶瘤腺病毒，使其表现出靶向性，也增强了溶瘤腺病毒的安全性。
5、溶瘤腺病毒的改造分为：1、e1a改造，2、e1b改造，3、e3区改造。e1a区域是病毒复制起始的调控区域]，包含三个保守区域cr1、cr2、cr3。其中cr2能结合视网膜细胞瘤突变基因(rb1-抑癌基因)，使细胞进入复制期。但肿瘤细胞中无rb调控，因此删除该区域不影响溶瘤腺病毒在肿瘤细胞内的增殖；e1b区域有两个细胞周期调控蛋白e1b-19k、e1b-55k，删除并不会影响溶瘤腺病毒在肿瘤细胞中的增殖，如e1b-55k激活tp53介导的凋亡通路，而肿瘤细胞中缺乏tp53；e3区改造集中在删除gp19k、删除e3b、删除adp。对溶瘤腺病毒的改造还有选择肿瘤特异性启动子进行调控，如cea启动子、survivin启动子或gp73启动子，均可实现针对癌细胞的靶向性。
6、cxcl9(又称mig)是一种cxc家族免疫趋化因子。cxcl9通常被干扰素γ所诱导，主要分布在th1、b细胞和nk细胞等，有介导和调节免疫及炎性反应的作用。cxcl9在人体内主要有三个作用：趋化作用、抑制血管生成、诱导细胞凋亡。
7、粒细胞－巨噬细胞集落刺激因子(gm-csf)，又称集落刺激因子2(csf2)，是由巨噬细胞、肥大细胞、nk细胞等分泌，是一种糖蛋白。csf2刺激粒细胞、巨噬细胞和树突状细胞(dc cell)的增殖分化，特别促进嗜中性粒细胞的增殖和成熟。发现gm-csf也可以作为一种免疫佐剂，来有效辅助提升治疗效果。由于gm-csf的免疫调节功能，对其在抗肿瘤领域研究较多，是抗肿瘤研究中非常重要的免疫因子。在临床研究中，gm-csf在肿瘤免疫治疗有很重要的抗肿瘤作用，有很好的临床应用前景。
8、现有的溶瘤腺病毒常规采用单一的基因疗法或病毒疗法策略，或者采用基因疗法结合病毒疗法策略，但是抑瘤效果还是不够理想。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31及其构建方法和应用，重组溶瘤腺病毒gov31具有溶瘤广谱性且抗肿瘤效果好，为病毒疗法、基因治疗、免疫疗法相结合的癌症靶向治疗提供了新方向。
2、本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
3、一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31，以溶瘤腺病毒sd55为载体，利用基因工程方法，构建携带干扰pdl1的shrna序列、cxcl9序列和gm-csf序列的重组溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf即为多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31，所述多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31同时表达干扰pd-l1的shrna、趋化因子cxcl9以及免疫因子gm-csf。
4、溶瘤腺病毒sd55经过删除e1b 55kd和采用肿瘤特异性启动子survivin的改造，来提高溶瘤效果和安全性。腺病毒的e1b 55kd区表达后与p53结合，p53诱导细胞发生凋亡，而肿瘤细胞中缺乏p53表达，因此可以删除e1b 55kd区。survivin蛋白在正常组织中不表达，而在肿瘤组织中高度表达，提高溶瘤腺病毒的安全性。
5、所述干扰pdl1的shrna序列为seq id no.1-seq id no.4其中之一。本发明首先设计并构建一个靶向pd-l1的小干扰shrna慢病毒载体，通过qpcr和western blot实验筛选出干扰pd-l1效率高的shrna序列。其中seq id no.3的干扰效率最高。
6、一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31的构建方法，包括如下步骤：
7、(1)合成u6-shrna片段和hcmv-cxcl9-t2a-gmcsf片段：
8、以含u6-shrna片段的质粒、含cxcl9-t2a-gmcsf片段的质粒为模板进行无缝克隆获得u6-shrna片段和hcmv-cxcl9-t2a-gmcsf片段；
9、(2)三片段无缝克隆
10、用hind iii单酶切，将psd55质粒线性化得到线性化psd55质粒，将线性化psd55质粒与u6-shrna片段和hcmv-cxcl9-t2a-gmcsf片段一起进行多片段无缝克隆得到连接产物；(3)sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf质粒构建
11、无缝克隆的连接产物转化dh5α感受态细胞后，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，利用ecorⅰ单酶切鉴定并测序验证，得到sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf质粒；
12、(4)溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf的构建
13、将sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf质粒线性化后，接着采用去磷酸化酶fastap去磷酸化，然后转化进bj583感受态细胞中进行重组，培养，挑选阳性克隆菌落，提取质粒，得到ad-sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf质粒，利用mluⅰ单酶切鉴定并测序验证，验证通过后表明构建的溶瘤腺病毒构建成功。
14、含u6-shrna片段的质粒是采用两种限制性内切酶bamhi、mlui线性化过表达plent-u6-cmv-copgfp-p2a-puro质粒，将线性化的质粒载体与shrna双链模版进行连接形成。
15、含cxcl9-t2a-gmcsf片段的质粒是合成cxcl9-t2a-gmcsf片段并连接到pca13质粒载体上形成。
16、步骤(2)中，线性化psd55质粒与u6-shrna片段和hcmv-cxcl9-t2a-gmcsf片段的摩尔比＝1:1.5:1.5。
17、一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
18、一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
19、一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
20、本发明的有益效果是：
21、本发明以溶瘤腺病毒sd55为载体，利用基因工程方法，构建携带pdl1-shrna序列与cxcl9、gm-csf序列的重组溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-gmcsf，同时表达干扰pd-l1的shrna、趋化因子cxcl9、免疫因子gm-csf，通过western blot实验验证敲降pd-l1和过表达cxcl9、gm-csf成功。本发明将干扰pd-l1的shrna、趋化因子cxcl9、免疫因子gm-csf组合，三个因子之间形成特定的作用协作配合关系，结合病毒的靶向作用，能显著提高抗肿瘤效果。
22、体外细胞实验中，通过mtt、结晶紫实验探究溶瘤腺病毒对肿瘤细胞的杀伤性，结果表明相比未改造病毒组ad-sd55，重组溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-gmcsf对非小细胞肺癌(a549)、结直肠癌(sw480)、胰腺癌(sw1990)都存在更显著的杀伤作用；honchest33342染色实验检测细胞凋亡，发现在溶瘤病毒处理后，非小细胞肺癌(a549)、结直肠癌(sw480)、胰腺癌(sw1990)都出现凋亡小体，重组溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-gmcsf比对照组ad-sd55，存活细胞数量更少且诱导产生更多凋亡小体。体外细胞实验表明重组溶瘤腺病毒对肺癌、结直肠癌、胰腺癌均具有很好的溶瘤效果。
1.一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31，其特征在于，以溶瘤腺病毒sd55为载体，利用基因工程方法，构建携带干扰pdl1的shrna序列、cxcl9序列和gm-csf序列的重组溶瘤腺病毒ad-sd55-shrna-cxcl9-t2a-gmcsf即为多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31，所述多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31同时表达干扰pd-l1的shrna、趋化因子cxcl9以及免疫因子gm-csf。
2. 根据权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31，其特征在于，所述干扰pdl1的shrna序列为seq id no.1- seq id no.4其中之一。
3.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
4.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，含u6-shrna片段的质粒是采用两种限制性内切酶bamhi、mlui线性化过表达plent-u6-cmv-copgfp-p2a-puro质粒，将线性化的质粒载体与shrna双链模版进行连接形成。
5.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，含cxcl9-t2a-gmcsf片段的质粒是合成cxcl9-t2a-gmcsf片段并连接到pca13质粒载体上形成。
6.根据权利要求3所述的构建方法，其特征在于，步骤（2）中，线性化psd55质粒与u6-shrna片段和hcmv-cxcl9-t2a-gmcsf片段的摩尔比=1:1.5:1.5。
7.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗非小细胞肺癌药物中的应用。
8.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗结直肠癌药物中的应用。
9.如权利要求1所述的一种多基因治疗的溶瘤腺病毒gov31在制备治疗胰腺癌药物中的应用。
