一、本发明涉及药用植物基因工程领域，特别是一种艾叶单萜合酶aatps46及其相关生物材料与应用。
背景技术：
0、二、背景技术
1、艾叶为菊科蒿属植物艾artemisia argyi levl.et vant.的干燥叶，通常在夏季花未开、叶茂盛时采摘，晒干。味辛、苦，性温，有小毒，具有理气血、逐寒湿、温经、止血、安胎等功效。艾分布于我国大部分地区，以及朝鲜半岛、日本、蒙古等亚洲东部。在我国，艾主产于河南、湖北、湖南、安徽、山东、河北等省。河南的“汤阴北艾”“南阳艾”、河北“祁艾”和湖北“蕲艾”都以质优而闻名。艾叶挥发油是艾发挥疗效的主要物质基础，具有明显的抗菌、抗病毒、抗炎、开窍、消肿止痛、止咳平喘等作用。
2、桉油精(1,8-cineole)又名1,8-桉叶(油)素，桉树脑等，是艾叶挥发油中含量较高且各产地共有的重要次生代谢产物，为2020版《中国药典》规定的含量测定项。桉油精具有广泛的生物活性，包括抑菌、抗炎、抗氧化以及促渗透作用，在医药、化妆品和香料工业领域皆有应用。近年来国内外对桉油精的抑菌、抗炎、镇痛、抗肿瘤、抗抑郁、神经保护、降血脂、防治糖尿病并发症等作用的研究日益深入，显示其尚有很大的开发潜力。
3、桉油精属于单环单萜化合物，通过胞浆的甲羟戊酸途径(mevalonic acid(mva)pathway)和质体的2-methyl-d-erythritol-4-phosphate(mep)途径生成萜类的通用底物异戊烯焦磷酸(isopentenyl pyrophosphate，ipp)及其异构体dimethylallylpyrophosphate(dmapp)，再由此生成单萜前体香叶基焦磷酸(geranyl diphosphate，gpp)，进一步由单萜合酶催化环化形成桉油精。从中药活性成分中开发新药是一种很有潜力的方式，然而由于植物的生长缓慢，有效成分在植物体中的含量不多，提取分离流程繁琐且易造成环境污染，因而大大限制了它的发展。通过探寻和阐释萜类成分在艾叶中的生物合成途径及其调控机制，有助于为药材品质的形成提供理论基础，同时为利用生物技术提高目标成分含量或直接生产有效成分带来广阔的应用空间，但目前尚未有任何公开或报道过本发明中所提及的艾叶单萜合酶aatps46基因及其氨基酸序列。
技术实现思路
0、三、
技术实现要素：
1、针对上述情况，为解决现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种艾叶单萜合酶aatps46及其相关生物材料与应用，可得到新的参与单萜化合物合成的艾叶单萜合酶，以合成或制备桉油精。
2、本发明解决的技术方案是，该艾叶单萜合酶aatps46，来源于艾(artemisia argyilevl.et vant.)，是以下a)或b)或c)的蛋白质：
3、a)氨基酸序列是seq id no.1所示的蛋白质；
4、b)在seq id no.1所示的蛋白质的n端和/或c端连接标签得到的融合蛋白质；
5、c)将seq id no.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有相同功能的蛋白质。
6、其中，seq id no.1由588个氨基酸残基组成。
7、上述蛋白质可人工合成，也可先合成其编码基因，再进行生物表达得到。
8、上述蛋白质中，蛋白标签(protein-tag)是指利用dna体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述蛋白标签可为flag标签、his标签、mbp标签、ha标签、myc标签、gst标签和/或sumo标签等。
9、上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
10、上述蛋白质中，所述90％以上的同一性可为至少91％、92％、95％、96％、98％、99％或100％的同一性。
11、与aatps46的相关生物材料也在本发明的保护范围之内。
12、本发明提供的与aatps46的相关生物材料为下述a1)至a12)中的任一种：
13、a1)编码aatps46的核酸分子；
14、a2)含有a1)所述核酸分子的表达盒；
15、a3)含有a1)所述核酸分子的重组载体；
16、a4)含有a2)所述表达盒的重组载体；
17、a5)含有a1)所述核酸分子的重组微生物；
18、a6)含有a2)所述表达盒的重组微生物；
19、a7)含有a3)所述重组载体的重组微生物；
20、a8)含有a4)所述重组载体的重组微生物；
21、a9)含有a1)所述核酸分子的转基因植物细胞系；
22、a10)含有a2)所述表达盒的转基因植物细胞系；
23、a11)含有a3)所述重组载体的转基因植物细胞系；
24、a12)含有a4)所述重组载体的转基因植物细胞系。
25、上述生物材料中，a1)所述核酸分子为以下b1)-b3)任一所示dna分子：
26、b1)seq id no.2第1-1767位所示的dna分子；
27、b2)编码序列是seq id no.2所示的dna分子；
28、b3)在严格条件下与b1)或b2)限定的dna分子杂交，且编码aatps46的dna分子。
29、其中，seq id no.2由1767个核苷酸组成，编码seq id no.1所示的蛋白质。
30、所述的严格条件是在2×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次5min，又于0.5×ssc，0.1％ sds的溶液中，在68℃下杂交并洗膜2次，每次15min。
31、其中，所述的核酸分子可以为dna，如cdna、基因组dna或重组dna，所述核酸分子也可以为rna，如mrna或hnrna。
32、上述生物材料中，a2)所述的含有编码aatps46的核酸分子的表达盒(aatps46基因表达盒)，是指能够在宿主细胞中表达aatps46的dna，该dna不但可包括启动aatps46转录的启动子，还可包括终止aatps46转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
33、上述生物材料中，所述的重组载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
34、上述生物材料中，所述的重组微生物可为酵母、细菌、藻或真菌，如农杆菌。
35、上述生物材料中，所述的转基因植物细胞系不包括繁殖材料。
36、本发明进一步提供了艾叶单萜合酶aatps46或其相关生物材料的应用。
37、所述应用具体如下所示：
38、1)上述艾叶单萜合酶aatps46作为单萜合酶的应用；
39、2)上述相关生物材料在制备单萜合酶中的应用；
40、3)上述艾叶单萜合酶aatps46或相关生物材料在制备或合成单萜化合物中的应用；
41、4)上述艾叶单萜合酶aatps46或相关生物材料在催化香叶基焦磷酸形成桉油精中的应用。
42、上述应用中，所述单萜化合物为桉油精。
43、本发明还提供了制备aatps46的方法。
44、本发明制备aatps46的方法，包括将aatps46的编码基因导入到受体微生物中，得到表达aatps46的重组微生物，培养所述重组微生物，表达得到aatps46。
45、上述方法中，所述受体微生物为原核微生物。具体的，所述原核微生物为大肠杆菌。更具体的，所述大肠杆菌为大肠杆菌表达菌株transetta(de3)。
46、上述方法中，所述aatps46的编码基因可通过重组质粒pet32a::aatps46导入到大肠杆菌表达菌株transetta(de3)中；所述重组质粒pet32a::aatps46是用seq id no.2所示的aatps46基因构建至pet32a(+)载体的bamhi酶切位点处，且保持pet32a(+)载体其他序列不变得到的重组表达载体。
47、本发明进一步提供了一种制备桉油精的方法，所述方法包括用aatps46催化香叶基焦磷酸(gpp)的步骤。
48、上述方法中，在催化过程中还需要加入酶促缓冲液，所述酶促缓冲液由hepes、mgcl2、dtt、pmsf组成；
49、所述hepes在所述酶促缓冲液中的浓度为50mm；
50、所述mgcl2在所述酶促缓冲液中的浓度为10mm；
51、所述dtt在所述酶促缓冲液中的浓度为5mm；
52、所述pmsf在所述酶促缓冲液中的浓度为1mm；
53、所述酶促缓冲液中的ph值为7.0。
54、上述方法中，所述方法还包括在用aatps46催化香叶基焦磷酸(gpp)后，得到桉油精。
55、本发明进一步还提供了一种桉油精的生物合成方法。
56、本发明桉油精的生物合成方法包括将aatps46的编码基因导入酿酒酵母得到重组酿酒酵母，发酵重组酿酒酵母，得到桉油精。
57、上述方法中，所述酿酒酵母具体为md酵母菌。
58、上述方法中，aatps46的编码基因可通过重组质粒pesc-leu::aatps46导入到md酵母菌中；所述重组质粒pesc-leu::aatps46是用seq id no.2所示的aatps46基因构建至pesc-leu载体的bamhi酶切位点处，且保持pesc-leu载体其他序列不变得到的重组表达载体。
59、本发明从艾叶叶片中克隆得到aatps46基因，该基因是首次从艾叶中得到的单萜类成分合成的关键酶基因，aatps46蛋白能够催化gpp形成桉油精(1,8-cineole)，不仅对艾叶中的桉油精等单萜类化合物的生物合成具有重要作用，也对于调节和生产植物单萜类化合物及培育高品质的艾叶具有重要的理论及实际意义。
1.一种艾叶单萜合酶aatps46，其特征在于，是以下a）或b）或c）的蛋白质：
2.与权利要求1所述的艾叶单萜合酶aatps46相关的生物材料，其特征在于，为下述a1）至a12）中的任一种：
3.根据权利要求2所述的艾叶单萜合酶aatps46相关的生物材料，其特征在于，a1）所述的核酸分子为如下1）或2）或3）所示的基因：
4.权利要求1所述的艾叶单萜合酶aatps46在制备单萜合酶或单萜化合物中的应用。
5.权利要求2或3所述的艾叶单萜合酶aatps46相关的生物材料在制备单萜合酶或单萜化合物中的应用。
6.权利要求1所述的艾叶单萜合酶aatps46在催化香叶基焦磷酸形成桉油精中的应用。
7.权利要求2或3所述的艾叶单萜合酶aatps46相关的生物材料在催化香叶基焦磷酸形成桉油精中的应用。
8.一种单萜化合物的合成方法，其特征在于，将权利要求1所述的艾叶单萜合酶aatps46、底物和酶促缓冲液混匀，反应，得到单萜化合物。
9.根据权利要求8所述的单萜化合物的合成方法，其特征在于，所述的底物为香叶基焦磷酸。
10.一种单萜化合物的生物合成方法，其特征在于，将权利要求1所述的艾叶单萜合酶aatps46导入酿酒酵母，生物合成单萜化合物。
