本发明属于分子生物学，涉及分子诊断试剂，具体涉及一种预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒及其分装和使用方法。
背景技术：
1、分子诊断技术是指以dna和rna为诊断材料，运用分子生物学技术，检测基因是否存在缺陷或表达异常，从而对样本的状态或疾病情况做出诊断的技术，对于疾病的预防、诊断、治疗和预后具有重要意义。常用的分子诊断技术包括pcr检测技术、基因芯片技术、基因测序技术等。分子诊断技术具有检测时间短、灵敏度更高、特异性更强等优势，被广泛应用于传染性疾病、血液筛查、遗传性疾病、肿瘤伴随诊断等领域。其中pcr检测技术是目前应用最成熟、市场份额最大的技术平台，在国内分子诊断中市占率为40%，在国内获批的分子诊断产品中，基于pcr检测技术的试剂超过90%。
2、pcr检测技术即核酸扩增检测技术，是在dna聚合酶催化下，以母链dna为模板以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等步骤，体外复制出与母链模板dna互补的子链dna的过程，是一项dna体外合成放大技术，能快速特异地在体外扩增任何目的dna，可用于基因分离克隆，序列分析，基因表达调控，基因多态性研究等许多方面。实时荧光pcr技术，是指在pcr反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累，实时监测整个pcr进程，最后通过扩增曲线对未知模板进行检测分析的方法。实时荧光pcr反应体系通常由反应缓冲液，酶，引物探针组成，组合成试剂盒产品通常是反应混合液（包含缓冲液、引物探针等）和酶分开不同的管子放置，使用时根据需要的检测反应数，将反应混合液和酶在离心管中进行混合，混合后进行分装至反应管，再加入样品进行上机检测。
3、通常情况下，生产厂家通常不会对反应液与酶进行预混，一方面由于酶与扩增反应液混合后环境改变易失活（尤其逆转录酶），另一方面聚合酶发生反应切割引物探针，直接混合分装的液体试剂稳定性较差，性能会在短期内下降。另外荧光pcr反应扩增能力强，极易造成实验污染，常规非预混的试剂盒使用时不同过程需要在不同的实验室中进行，试剂的配制和分装过程如果实验室存在污染容易造成实验失败；并且在需要大批量呼吸道细菌核酸检测时，每一批每一管体系间可能会有偏差；且操作人员的操作水平，也会对实验结果造成影响。因此预分装的试剂盒可以精简操作步骤、降低对操作人员的要求、降低实验过程中被污染的概率。
4、常规的实现预分装的方法是进行试剂冻干，但冻干过程复杂，对试剂原材料的要求也比较高，生产过程耗时耗力，客户在收到产品后仍需要在反应管中加入水进行复溶后使用，客户使用仍相对不便，因此如何实现直接液体分装使用，对于试剂生产和客户使用均具有较大的意义。中国专利申请文献cn114657236a公开了的一种通过石蜡层分割扩增反应液和酶混合液的反应管，将酶混合液放置在反应管上层，反应液放置在下层，中间用石蜡层分割，简化了操作步骤。然而，反应体系中酶混合液含量远远低于反应液含量，将酶混合液放置在空间大的上层，极易导致其在运输过程中因颠簸而悬挂在管子的四周，造成酶混合液挥发，进而影响实验结果。且该石蜡与反应液和酶均为无色液体，在使用时无法有效判断中间石蜡层是否完好，不能确上层酶液与下层反应液混合，不能确认试剂盒的稳定性是否受影响，有可能给检测造成负面的影响。
5、因此，如何克服上述的缺点，开发出一款操作简单方便，稳定性有保证的预分装检测试剂盒，更加便于检测人员的使用仍是亟待解决的问题
技术实现思路
1、为了解决上述存在的问题及为了达到上述的目的，本发明提供一种预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒及其分装和使用方法，将酶溶液置于最底层，最上层为反应混合液，中间通过改进的石蜡层分割，不仅便于后续使用时离心，确保管壁无溶液残余，且提升了间隔的稳定性及透光性，并合适的熔点保证其在常温时液体状态便于使用。具体技术方案如下：
2、首先，本发明提供一种预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，包括预分装在分装反应管中的反应体系所需量的酶溶液组分和反应液组分；所述酶溶液组分位于分装反应管的底部，所述反应液组分位于分装反应管的上部，所述酶溶液组分和反应液组分之间通过改进石蜡层分割，使用时省去了配液过程，直接加样检测；所述改进石蜡层为液体石蜡、固体石蜡、明胶按一定的比例混合制备而成；所述反应液组分中含有颜色指示剂。
3、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，所述改进石蜡层中液体石蜡、固体石蜡、明胶的混合体积比为0.5:1:12～20。
4、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，所述颜色指示剂溴麝香草酚蓝，其在反应液组分中的质量百分比浓度为0.05%。
5、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，所述酶溶液组分为dna聚合酶与酶稀释液按比例进行混合而成。所述酶稀释液为20%的甘油溶液。
6、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，所述反应液组分为缓冲液、dntps（100mm）、mg2+（100mm）、稳定剂、引物探针（100μm）、h2o以及所述颜色指示剂进行按比例（体积比：10:0.5:0.5:0.3:0.2:0.5:3:1）混合而成。
7、其次，本发明提供一种前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，包括如下工艺步骤：
8、1）按照要求分别配制酶溶液组分和反应液组分备用；
9、2）将液体石蜡、固体石蜡、明胶按预定的体积比进行混合，获得石蜡混合液，备用；
10、3）取反应体系所需量的酶溶液组分装至分装反应管的底部；
11、4）在酶溶液组分上装入一定量的石蜡混合液，2000rpm/min低速瞬时离心，并在-20℃下放置一段时间，进行石蜡固化，形成改进石蜡层；
12、5）将分装反应管置于不高于10℃的低温环境下，在改进石蜡层上方加入反应体系所需量的反应液组分；
13、6）封口，并在-20℃下储存，即可。
14、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，所述反应液组分中的颜色指示剂溴麝香草酚蓝的配制方法为：取溴麝香草酚蓝0.1g，加50mm naoh 溶液6ml，再加去离子水配置成1%溴麝香草酚蓝溶液，备用。
15、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，所述分装反应管中装入的酶溶液组分、反应液组分及石蜡混合液的量分别为：酶溶液组分2μl，反应液组分13μl，石蜡混合液8μl。
16、再次，本发明提供一种前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的使用方法，将预分装的反应管取出，室温解冻，瞬时离心，移去封盖或封膜，直然后接加入呼吸道细菌核酸或对照样品，于低速离心机上混匀后上机检测。
17、前述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的使用方法，加入的呼吸道细菌核酸或对照样品的量为5μl，上机检测时间为1个小时。
18、本发明具备的有益效果如下：
19、1）本发明产品在很大程度上减少了荧光pcr操作流程，省去了配液过程，降低了操作过程中实验结果被污染的几率。
20、2）本发明对于中间起物理隔绝的石蜡层进行了组份的改进，液体石蜡、固体石蜡、明胶按一定的比例进行混合，提升了其间隔的稳定性，同时保证透光性，合适的熔点保证其在常温时液体状态便于使用。
21、3）本发明对预分装的不同层组分设置进行了调整，最底层为酶溶液，中间为石蜡层，最上层为反应混合液（缓冲液、引物探针等），便于后续使用时离心，确保管壁无溶液残余，使用时解冻后进行离心，由于上层溶液量大，根据密度差异，上层反应液离心至下层与酶混合，中间层石蜡密度小漂浮至上层，便于使用。
22、4）本发明在反应混合液中添加了合适的带有颜色的指示剂，在分装后最上层为肉眼可见的蓝色，与中间层有明显的界限颜色区分，如中间层破损上层反应液进入下层，对于中间层是否保持完好起到了监测的作用，保证了试剂盒的质量。
1.一种预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，其特征在于：包括预分装在分装反应管中的反应体系所需量的酶溶液组分和反应液组分；所述酶溶液组分位于分装反应管的底部，所述反应液组分位于分装反应管的上部，所述酶溶液组分和反应液组分之间通过改进石蜡层分割，使用时省去了配液过程，直接加样检测；
2.根据权利要求1所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述改进石蜡层中液体石蜡、固体石蜡、明胶的混合体积比为0.5:1:12～20。
3.根据权利要求1所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述颜色指示剂溴麝香草酚蓝，其在反应液组分中的质量百分比浓度为0.05%。
4.根据权利要求1所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述酶溶液组分为dna聚合酶与酶稀释液按比例进行混合而成。
5.根据权利要求1所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒，其特征在于：所述反应液组分为缓冲液、dntps、mg2+、稳定剂、引物探针、h2o以及所述颜色指示剂进行按比例混合而成。
6.一种根据权利要求1-5任意一项所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，其特征在于：包括如下工艺步骤：
7.根据权利要求6所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，其特征在于：所述反应液组分中的颜色指示剂溴麝香草酚蓝的配制方法为：取溴麝香草酚蓝0.1g，加50mm naoh 溶液6ml，再加去离子水配置成1%溴麝香草酚蓝溶液，备用。
8.根据权利要求6所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的分装方法，其特征在于：所述分装反应管中装入的酶溶液组分、反应液组分及石蜡混合液的量分别为：酶溶液组分2μl，反应液组分13μl，石蜡混合液8μl。
9.一种根据权利要求1-5任意一项所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：将预分装的反应管取出，室温解冻，瞬时离心，移去封盖或封膜，直然后接加入提取的样本核酸或对照样品，于低速离心机上混匀后上机检测。
10.根据权利要求9所述的预分装呼吸道细菌核酸检测试剂盒的使用方法，其特征在于：加入的提取的样本核酸或对照样品的量为5μl，上机检测时间为1个小时。
