本发明属于生物，具体涉及一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法和应用。
背景技术：
0、技术背景
1、登革热是由登革热病毒经伊蚊等蚊虫传播至人体而引发的急性传染病，临床表现涉及类似无症状的流感到由于血管通透性增加引起体液流式和器官功能障碍而具有致死性。登革热已成为影响全球卫生问题，世卫组织曾于2019年报告了520万例登革热感染病例，近年来约有39亿人面临感染风险，涉及129个国家和地区。登革热已是亚洲和拉丁美洲国家的主要严重疾病，该病毒致死率较高，在不发达地区住院患者的死亡率高达10％。因此，登革热的快速诊断对于临床治疗和病理学研究至关重要。
2、登革热病毒属于黄病毒科黄病毒属，由四种血清型组成。该病毒具有一种二十面体对称的包膜结构，含单链正极性基因组。登革热非结构蛋白(ns1)是登革热病毒中保守程度较高的蛋白，大小为48–50kda。ns1作为多聚蛋白的一部分从病毒rna翻译而来，进一步形成ns1二聚体。在人体内，二聚体形式的ns1蛋白进一步形成多聚体而释放至血液中。因此，ns1成为登革热的重要诊断标志物之一。除此以外ns1还被证明在病毒致病过程中发挥重要作用。也有研究表明，严重的登革热疾病与登革热感染患者血浆中循环ns1水平高相关(limp-y,ramapraba a,loyt,rouers a,thein t-l,leoy-s,etal.(2023)anonstructuralprotein 1capture enzyme-linkedimmunos orbent assay specific fordengueviruses.plos one 18(5):e0285878.)。
3、传统的登革热疾病诊断方法，如病毒rna检测等，存在操作复杂，耗时长且成本较高等缺点，亟需一种更加快速灵敏的手段作为登革热的预诊断方式。目前，已有商业化酶联免疫测定试剂盒检测血液中登革热ns1蛋白。然而，传统单克隆抗体作为免疫分析法的常用检测原件，存在成本高、稳定性差、难以大规模生产等不足，限制了免疫分析法的灵敏度和准确性。因此开发一种高灵敏性，强特异性的识别元件代替单克隆抗体是十分必要的。纳米抗体一种是从骆驼重链抗体中提取的约15kda的蛋白质片段，是目前已知最小的与抗原特异性结合的结构。纳米抗体通常表现出优异的热稳定性和构象稳定性。因此，基于纳米抗体的免疫分析法非常适合病原体的检测。此外，纳米抗体可大量表达，制备成本较低，与靶标的特异性识别能力强，灵敏度高，在疾病的快速诊断和治疗领域显示出巨大的应用潜力。
技术实现思路
1、基于上述研究背景，解决传统单克隆抗体存在的不足，本发明旨在开发高灵敏、强特异的纳米抗体，以代替传统单克隆抗体，应用于各种登革热病毒检测分析平台。
2、首先，本发明提供一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体，所述纳米抗体为vhh抗体，具有seq id no：1所示的氨基酸序列。该纳米抗体与登革热病毒ns1蛋白有着优异的结合性能及特异性。
3、进一步的，所述的vhh抗体片段具有seq id no：2所示的核苷酸序列。
4、其次，本发明提供一种以上所述的靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，该方法包括：
5、(1)将登革热病毒ns1蛋白表达质粒转化大肠杆菌bl21(de3)，培养至对数生长期后使用异丙基-β-d-硫代半乳糖苷(iptg)诱导工程菌表达，将表达的登革热病毒ns1蛋白进行ni-nat柱进行纯化获得高纯度蛋白，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sds-page)、elisa鉴定登革热病毒ns1蛋白。
6、(2)提取未免疫羊驼淋巴细胞并提取总rna，合成cdna并利用pcr扩增编码vhh基因的片段，快切酶酶切后用t4连接酶与噬菌粒pcomb3xss重新连接，将重组噬菌粒转入大肠杆菌tg1中，构建纳米抗体天然噬菌体文库，测定库容约为2×1010，序列重复性较低，多样性良好。
7、(3)将表达的登革热病毒ns1蛋白包被至酶标孔，投入重组噬菌体孵育一段时间，使用pbst洗去非特异性结合的重组噬菌体，酸洗脱特异性结合噬菌体，扩增洗脱的噬菌体，测定滴度，用于下一轮淘选或分析。按照“吸附-洗涤-洗脱-扩增”步骤进行3-5轮筛选，通过在筛选的过程中改变pbst的浓度、噬菌体孵育时间等条件，层层递进，以筛选到亲和力及特异性更强的纳米抗体噬菌体。
8、(4)经过几轮筛选，随机选取20个噬菌体进行phage-elisa的鉴定，使用登革热病毒ns1蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白做为作为阴性对照，pbs作为空白对照；获取了3个效果较佳与登革热病毒ns1蛋白特异性结合的重组噬菌体展示纳米抗体，将这3个纳米抗体噬菌体进行扩增、质粒提取、测序，获取1种纳米抗体。
9、进一步的，本发明所述登革热病毒ns1蛋白由原核表达系统产出；所述洗脱法的ph值为2-10。
10、进一步的，本发明纳米抗体噬菌体展示文库的构建方法，包含如下步骤：
11、(1)从羊驼淋巴细胞扩增编码纳米抗体基因的片段，在纳米抗体两端引入sfi i酶切位点；
12、(2)与噬菌粒pcomb3xss酶切重组，t4连接酶进行连接构建噬菌体展示文库。
13、进一步的，所述ph洗脱法筛选，包含如下步骤：
14、(1)包被2.5-30μg/ml登革热病毒ns1蛋白至400μl酶标孔，4℃包被10-14h；
15、(2)0.05-0.25％pbst洗板5-10次，牛血清包蛋白(bsa)或卵清白蛋白(ova)37℃封闭1-2h；
16、(3)0.05-0.25％pbst洗板5-10次，投入2×1010重组噬菌体，37℃孵育60-120min；
17、(4)0.05-0.25％pbst洗板5-10次，100-200μl 0.1m gly-hcl(ph＝2.2)孵育8-10min，加入30-45μl 1m tris-hcl(ph＝9.1)，测定滴度，并挑取单克隆噬菌体进行phage-elisa鉴定。
18、进一步的，所述重组噬菌体由噬菌粒pcomb3xss和辅助噬菌体m13k07重组构建。
19、第三方面，本发明提供了一种以上所述的靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的应用，本发明的噬菌体展示纳米抗体与登革热病毒ns1蛋白可特异性结合，以作为传统登革热病毒ns1蛋白单克隆抗体的替代元件，应用于登革热的免疫分析领域。
20、本发明具有以下技术效果：
21、(1)与传统的单抗相比，本发明的噬菌体展示纳米抗体具有尺寸小、稳定性高制备简便、成本低廉、可大规模生产等优点。
22、(2)本发明的1条纳米抗体序列是国内外首次报道，具有较高的创新性。
23、(3)本发明提供的噬菌体展示纳米抗体可做为核心检测元件，应用于多种检测登革热病毒的免疫分析平台。
1.一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体为vhh抗体，具有seq id no：1所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体，其特征在于，与登革热病毒ns1蛋白有着优异的结合性能及特异性。
3.编码权利要求2所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的核苷酸，其特征在于，vhh抗体片段具有seq id no：2所示的核苷酸序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，包含如下步骤：
5.根据权利要求4所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述登革热病毒ns1蛋白由原核表达系统产出；所述洗脱法的ph值为2-10；所述鉴定噬菌体特异性使用蛋白为登革热病毒ns1蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白。
6.根据权利要求4所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述的纳米抗体噬菌体展示文库的构建方法，包含如下步骤：
7.根据权利要求4所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述ph洗脱法筛选，包含如下步骤：
8.根据权利要求7所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的制备方法，其特征在于，所述重组噬菌体由噬菌粒pcomb3xss和辅助噬菌体m13k07重组构建。
9.权利要求1-3任一项所述的一种靶向登革热病毒ns1蛋白纳米抗体的应用，其特征在于，所述纳米抗体应用于登革热病毒的多种免疫分析平台。
