本发明属于基因编辑，具体涉及一种帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法。
背景技术：
1、帕金森病(parkinson disease，pd)是一种进行性神经退行性疾病，中脑黑质多巴胺能神经元的丢失和路易体的蛋白质包涵体的存在是其主要病理特征。患者通常表现出运动障碍，包括静止性震颤、运动迟缓、姿势不稳以及颈部、躯干和四肢强直等。随着人口的老龄化，全世界范围内的帕金森病患者数量正快速上升。
2、近年来的研究表明，表观基因组改变在帕金森病的神经病理和病因学中起着重要作用。此外，已有的研究报道显示线粒体功能障碍在帕金森病发病过程扮演着关键角色。神经毒性农药——鱼藤酮可以诱导体外培养的多巴胺能神经元的核心组蛋白乙酰化，与此同时，暴露于鱼藤酮的多巴胺能神经元线粒体发生了严重功能障碍。另据报道，在帕金森病的动物模型和人类帕金森病患者的大脑中，核心组蛋白的乙酰化水平增加，提示多巴胺能神经元线粒体功能障碍与核心组蛋白超乙酰化在帕金森病中具有相关的病理机制联系。
3、暴露于鱼藤酮的多巴胺能神经元线粒体发生严重功能障碍。因此，运用一定浓度的神经毒性药物鱼藤酮处理体外培养的多巴胺能神经元细胞，可以损伤这些细胞的线粒体，诱导出体外帕金森病细胞模型。然而，虽然短时间鱼藤酮暴露可以诱导神经元细胞线粒体损伤，但是效率很低，难以快速获得大量高纯度线粒体损伤细胞用于研究。因此，开发可用于帕金森病相关线粒体损伤的细胞模型具有重要应用价值。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，解决现有技术中鱼藤酮暴露诱导多巴胺能神经元细胞线粒体损伤效率低，无法大量获得高纯度线粒体损伤细胞的不足。
2、为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
3、一种帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，包括以下步骤：
4、s1、构建靶向线粒体转录因子tfam序列的质粒载体，然后转染慢病毒，得到特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒；
5、s2、以完全培养基对多巴胺能神经元细胞n27进行培养并感染所述特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒，继续培养；
6、s3、利用筛选培养基对感染慢病毒的多巴胺能神经元细胞n27进行培养，筛选获得帕金森病相关线粒体损伤细胞。
7、本发明中，s1中特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒具体通过以下方式获得：
8、s101、构建靶向线粒体转录因子tfam序列的grna质粒；
9、s102、利用293ft细胞转染包装crispr/cas9 tfam-ko慢病毒，转染后收集慢病毒，浓缩后冻存备用。
10、进一步地，冻存温度为-80℃。
11、进一步地，所述靶向线粒体转录因子tfam序列为靶向线粒体tfam 1号外显子的序列。
12、进一步地，采用mission lentiviral packaging mix试剂盒进行质粒转染293ft细胞。
13、本发明中，s2中对多巴胺能神经元细胞n27进行培养并感染所述特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒,具体过程如下：将多巴胺能神经元n27细胞密度调整至1×106～5×106/ml，接种于培养容器中，待细胞接触融合达90％时，感染crispr/cas9 tfam-ko慢病毒，慢病毒感染复数为100个moi，继续培养于完全培养基中。
14、本发明中，所述筛选培养基是在完全培养基基础上加入嘌呤霉素。
15、进一步地，所述筛选培养基中嘌呤霉素含量为50μg/ml。
16、一种帕金森病相关线粒体损伤细胞，通过上述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法得到。
17、本发明具有以下有益效果：
18、(1)本发明帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法利用crispr/cas9基因编辑技术将多巴胺能神经元中的tfam基因精准敲除，与现有的鱼藤酮暴露诱导线粒体损伤细胞模型相比，最终获得了帕金森病相关线粒体损伤细胞，具有更好的细胞均一性，可在体外重复快速扩增，效率高，极大提高实验可重复性。
19、(2)本发明构建的帕金森病相关线粒体损伤细胞模型与鱼藤酮暴露诱导多巴胺能神经元细胞线粒体损伤表型一致，帕金森病相关线粒体损伤的多巴胺能神经元细胞显著降低tfam蛋白的表达，展现出典型的线粒体损伤表型以及核心组蛋白超乙酰化水平(h3k27ac)，可作为体外研究与帕金森病相关的表观遗传分子机制的细胞模型。
20、(3)本发明细胞制品制备过程中，不涉及运用对人体神经元有毒性的环境毒素——鱼藤酮，对使用者具有更高的安全性。
1.一种帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，s1中特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒具体通过以下方式获得：
3.根据权利要求2所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述靶向线粒体转录因子tfam序列为靶向线粒体tfam 1号外显子的序列。
4.根据权利要求3所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述靶向tfam 1号外显子的序列如seq id no:1。
5.根据权利要求2所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，采用mission lentiviralpackaging mix试剂盒进行质粒转染293ft细胞。
6.根据权利要求5所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，s2中对多巴胺能神经元细胞n27进行培养并感染所述特异性靶向线粒体转录因子tfam的慢病毒,具体过程如下：将多巴胺能神经元n27细胞密度调整至1×106～5×106/ml，接种于培养容器中，待细胞接触融合达90％时，感染crispr/cas9 tfam-ko慢病毒，慢病毒感染复数为100个moi，继续培养于完全培养基中。
7.根据权利要求1所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述筛选培养基是在完全培养基基础上加入嘌呤霉素。
8.根据权利要求7所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法，其特征在于，所述筛选培养基中嘌呤霉素含量为50μg/ml。
9.一种帕金森病相关线粒体损伤细胞，其特征在于，通过权利要求1-8任一项所述帕金森病相关线粒体损伤细胞模型的构建方法得到。
