本发明属于分子医学，具体是涉及一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂。
背景技术：
1、梅毒(syphilis)是一种由梅毒螺旋体(treponemapallidum，tp)引起的性传播疾病，其病原体是梅毒螺旋体，属螺旋体科。梅毒螺旋体主要通过性接触、输血、创口或者胎盘等途径传播。梅毒螺旋体从感染区附近的淋巴结进入血液播散全身，使机体几乎所有的组织及器官受累，临床表现为全身性的，可分为不同临床阶段，包括一期、二期、三期和潜伏期。隐性梅毒患者无自觉症状，处于临床静止期(也称之为潜伏梅毒)，但仍具有传染性，可传染给胎儿或他人，是重要的传染源。一旦机体抵抗力下降，隐性梅毒将重新发作，进展为显性梅毒。研究表明约20％隐性梅毒可进展为神经梅毒。此外，抗生素尽管已经应用于各类梅毒的治疗，并有效控制患者继发的各种并发症，但不论使用哪种规范的治疗方案，都有治疗失败的可能，其中梅毒血清固定现象高达30％。鉴于梅毒螺旋体尚难于体外常规培养，至今没有直接有效的方法可以评价治疗效果。
2、已有的文献和国内外指南曾认为，梅毒螺旋体非特异性抗体检测可用于评估梅毒疾病活动度或传染性，即随访滴度降低4倍以上或血清转阴表明治疗有效或治愈(satyaputraf.,hendry s.,braddick m.,et al.the laboratory diagnosis ofsyphilis[j].journal ofclinical microbiology,2021,59(10):e0010021.10.1128/jcm.00100-21)，但其敏感性和特异性受到感染的分期和免疫抑制的严重程度的影响(kojima n.,siebert j.c.,maecker h.,et al.cytokine expression intreponemapalliduminfection[j].jtranslmed,2019,17:9.10.1186/s12967-019-1947-7)。此外，最近的动物试验研究显示，宿主梅毒螺旋体非特异性抗体的滴度变化与抗生素治疗无关，其滴度降低4倍以上或血清转阴均可能是一种自然过程。如何梅毒的活动性和传染性，如何判断是否治愈，仍然是当前梅毒防控的难点，需要找到存在活的梅毒螺旋体的直接证据。
3、梅毒螺旋体dna的载量可以反映梅毒螺旋体的存在以及数量，但不能区分活的或死的梅毒螺旋体。病原体mrna很容易降解，半衰期短，其存在表明存在活的病原体，提示具有传染性或尚未治愈。虽然有研究在梅毒患者的精液标本中检出梅毒螺旋体rna(godornes,charmie,ciccarese,et al.treponema pallidum subsp.pallidum dna andrna in semen ofa syphilis patient without genital oranal lesions[j].)，但目前被广泛研究并快速发展的pcr体系通常以梅毒螺旋体dna片段为靶标，尚未有成熟的pcr体系被建立并用于评估检测梅毒感染者体内的梅毒螺旋体基因组dna转录产生的mrna。梅毒螺旋体基因tp47(47kda脂蛋白)为特异性47-kda脂蛋白基因，是梅毒螺旋体最常见的表达基因，具有高度的特异性，该47-kda蛋白为青霉素结合蛋白，与青霉素类的治疗密切相关梅毒螺旋体pola基因(dna polymeraseⅰgene oft.pallidum)，是梅毒螺旋体的管家基因，序列具有高度的保守性，其特别功能区，有丰富的半胱氨酸和四个独一无二的插入区，在dna复制与修复中起重要的作用，应用pola基因检测梅毒螺旋体，有较高的敏感性和特异性。梅毒螺旋体基因bmp基因(basic membrane protein gene)编码39kda碱性膜蛋白，梅毒螺旋体bmp基因的检测，其特异性与血清学比较检测结果，符合率达到88％-96％。同时检测以上三个靶基因，可以最大限度提升灵敏度，减少由于突变或表达水平等因素造成的漏检。
技术实现思路
1、本发明的第一目的在于提供一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂。
2、本发明的第二目的在于提供一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备方法。
3、本发明所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，包括pcr反应液、酶反应液、标准品、阴性对照品和阳性对照品。
4、所述pcr反应液的成份含有dntp/dutpmix、mg2+、4对引物探针混合物和ddh2o。
5、所述酶反应液的成份含有hiscript ii reverse transcriptase、rnaseinhibitor、heat-labile udg和takarataqhsdnapolymerase。
6、所述标准品(含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和bmp基因及人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液)包括1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml和1.0×107copies/ml共6个浓度。
7、所述阴性对照品为不含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和bmp基因，只含人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。
8、所述阳性对照品为含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因和bmp基因及人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。
9、所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备方法，包括以下步骤：
10、1)靶基因筛选与制备
11、从ncbi上下载梅毒螺旋体的tp47基因、pola基因、bmp基因和人类的rnasep基因核酸序列，根据引物设计原则，借助ncbi-primer blast、dnaman、primerpremier 5和tmutility等软件进行辅助设计，同时对这4个靶点分别设计一条带有不同荧光基团的taqman探针，tp47基因的探针为fam荧光基团、pola基因的探针为hex荧光基团、bmp基因的探针为rox荧光基团、rnasep基因为cy5荧光基团，由于这4条探针上的荧光基团具有不同的发射波长，因此可以根据不同波长的通道对这4个基因的扩增情况进行区别判断(图1)。接着，对设计好的引物用ncbi的primer blast工具进行在线的基因组和转录组同源比对，以确保设计的引物特异性良好，无潜在的非特异性扩增靶标。最后合成验证后的引物和探针，将合成验证后的引物和探针进行4000rpm，30s离心，用tris-edta缓冲液按照说明书进行溶解和稀释，之后用nanodrop 2000对引物和探针进行定量，稀释至100μm放置于-20℃作为储存溶液，稀释至10μm放置于4℃作为工作溶液。
12、2)靶基因装甲rna的构建
13、制备含靶基因装甲rna溶液：采用基于单质粒双表达系统对梅毒螺旋体进行装甲rna构建。以pet-24a(+)质粒作为载体，插入的外源基因包括梅毒螺旋体tp47基因、pola基因、bmp基因和人类的rnasep基因片段，并在该外源基因的前面插入t7终止子、启动子以及pac site共计约2700nt，使该外源基因能够独立于外壳蛋白基因而作为独立表达的序列。我们以bamhⅰ和hindⅲ为酶切位点，对外源片段进行基因合成后插入到pet-24a(+)表达载体，获得重组质粒petms2-tp，并用重组质粒petms2-tp对大肠杆菌bl21(de3)进行转化。再通过对大肠杆菌进行细胞破碎，获得含靶基因的装甲rna，然后进行双酶切实验并通过琼脂糖凝胶电泳观察产物条带，酶切后的装甲rna溶液置于75℃干浴5min，破坏其外壳蛋白，用rt-qpcr进行扩增验证两个外源目的片段是否存在。对rt-qpcr的扩增产物进行回收，对产物进行sanger测序验证，然后利用dnaman软件将测序结果与靶片段序列进行比对，判断扩增产物是否正确。sds-聚丙酰胺凝胶电泳验证用于初步判断其外壳是否有表达。最后采用peg沉淀法浓缩纯化含靶基因的装甲rna，将已知浓度的质粒倍比稀释后与纯化后的含靶基因的装甲rna同时进行rt-qpcr扩增，计算含靶基因装甲rna的浓度，获得已知浓度的含靶基因装甲rna溶液，用于标准品的制备。
14、3)pcr反应液制备
15、dntp/dutp mix、mg2+、4对引物探针混合物和无菌无酶的ddh2o共同组成pcr反应液。
16、4)酶反应液制备
17、vazymehiscript ii reverse transcriptase、vazyme rnase inhibitor、vazymeheat-labile udg、takarataqhsdnapolymerase共同组成酶反应液。
18、5)对照品制备
19、阴性对照品制备：不含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因、bmp基因，只含人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。
20、阳性对照品制备：含梅毒螺旋体tp47基因、pola基因、bmp基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液。
21、6)标准品制备和标准曲线的建立
22、用tris-edta缓冲液稀释含tp47基因、pola基因、bmp基因和人类rnasep基因的目标片段的装甲rna溶液，选择1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×107copies/ml 6个浓度作标准品，分别以每个浓度标准品作模板进行荧光定量反应，确定线性范围。所述标准品浓度不限于1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml、1.0×107copies/ml 6个浓度。
23、7)样品处理方法的建立
24、使用梅毒螺旋体多靶mrna试剂的样本主要包括组织、血液、生殖道分泌物和脑脊液等临床标本。采用tiangen总rna提取试剂提取样本中的rna核酸片段。样本核酸提取后得到的rna溶液选用thermo fisher scientific的dna-freetmdna去除试剂依照说明书去除样本中残留的dna。
25、8)用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备
26、pcr反应液、酶反应液、标准品和对照品共同组成用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂。
27、在步骤1)中，所述梅毒螺旋体tp47基因、pola基因、bmp基因和人类rnasep基因的高特异性基因探针和引物的序列如下：
28、
29、荧光探针的5'端分别添加荧光报告基团为fam、hex、rox和cy5。
30、在步骤3)中，所述引物的浓度为0.2μmol/μl，荧光探针的浓度为0.05μmol/μl。
31、本发明在同一反应管中同时实现了对梅毒螺旋体tp47基因、pola基因、bmp基因和人类rnasep基因的检测，同时采用一步法rt-qpcr，将逆转录和核酸扩增步骤相结合，在减少污染发生的同时节省时间，且pcr反应液内含的dutp和酶反应液内含的udg酶共同构成了防污染体系，进一步降低环境中气溶胶污染对实验结果可能带来的不利影响，确定梅毒患者体内梅毒螺旋体mrna含量从而评估梅毒螺旋体是否具有传染性或判断疗效。
1.一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，该试剂包括使用4对引物和探针，用于对梅毒螺旋体相关基因样本进行多靶实时荧光定量检测，所述4对引物和探针的序列如下：
2.如权利要求1所述一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，所述荧光探针的5'端分别添加荧光报告基团为fam、hex、rox和cy5。
3.如权利要求1所述一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，其特征在于所述试剂还包括pcr反应液、酶反应液、标准品和对照品。
4.如权利要求3所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，其特征在于所述pcr反应液包含dntp/dutpmix、mg2+、4对引物探针混合物和ddh2o。
5.如权利要求3所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，其特征在于所述酶反应液包含vazymehiscript ii reverse transcriptase、vazyme rnaseinhibitor、vazyme heat-labile udg和takarataqhsdnapolymerase。
6.如权利要求3所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，其特征在于所述对照品包括阴性对照品和阳性对照品。
7.如权利要求3所述用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂，其特征在于所述标准品包括1.0×102copies/ml、1.0×103copies/ml、1.0×104copies/ml、1.0×105copies/ml、1.0×106copies/ml和1.0×107copies/ml共6个浓度，但不限于此6个浓度的标准品。
8.如权利要求1所述一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备方法，其特征在于所述方法包括以下步骤：
9.如权利要求8所述如权利要求1所述一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备方法，其特征在于待检测样本为组织、血液、生殖道分泌物的临床标本。
10.如权利要求8所述如权利要求1所述一种用于梅毒传染性和疗效判断的梅毒螺旋体多靶mrna试剂的制备方法，其特征在于所述pcr扩增的反应仪器包括-96s全自动医用pcr分析系统。
