本发明属于生物医药领域，特别涉及一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料及其制备和应用。
背景技术：
1、癌症是危害人类生命的罪魁祸首之一。近年来，许多新的纳米材料和技术涌现出来，以提高未来临床癌症诊断和治疗的效率。基于芬顿、类芬顿反应的化学动力学疗法(cdt)以其高选择性、内源性刺激、低耐药性等优良的特性，以及高效抗肿瘤治疗效果，引起了研究者的极大关注。然而，cdt仍面临高谷胱甘肽(gsh)、低过氧化氢(h2o2)和非最佳ph等复杂病理微环境的影响，难以发挥理想的治疗效果和临床应用。因此，在过去几年中，人们探索了多种可配置纳米材料的巧妙设计，以提高cdt效率。纳米材料独特的特性为cdt的合理设计和临床应用提供了更多的可能性。
2、cdt与其他基于ros的疗法相比，有几个被广泛接受的优势：(1)由于tme的特异性酸度和相对高浓度的h2o2，因此具有优异的靶向效率；(2)依赖于肿瘤过度表达的h2o2，而不是缺氧tme下氧和外源场的辅助；(3)通过增加h2o2或降低谷胱甘肽(gsh)水平来调节tme的氧化应激，从而实现增强的治疗效果；(4)不需要复杂和昂贵的医疗条件来进行适当的治疗。尽管cdt已经取得了一定的治疗效果，但仍迫切需要解决cdt的一些缺陷。首先，肿瘤细胞内的h2o2浓度相对较高，但仍不足以有效催化fenton反应，同时高浓度的内源性gsh可以快速清除cdt产生的ros。其次，fenton反应较窄的最佳ph在一定程度上限制了cdt的体内应用。第三，现有的大多数cdt试剂的催化效率相对较低，在复杂的生理微环境中无法达到理想的催化效果。因此，在当前cdt开发阶段及其临床前阶段，迫切需要开发能调控tme和具有高催化效率的cdt试剂。
3、聚酰胺-胺树状大分子(pamam)因其分子结构的高度分散性，可精准控制的三维结构，表面有大量可以被修饰的官能团和内部有较大的疏水空腔，可以用作纳米载体或支架，用于负载cdt试剂。
4、检索国内外文献尚没有发现关于利用负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米平台用于增强cdt的诊疗一体化的研究。
技术实现思路
1、本发明所要解决的技术问题是提供一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米平台及其制备和应用。
2、本发明的一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料，所述纳米材料以第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5表面修饰对羧基苯磺酰胺bs，内部包裹过氧化铜纳米颗粒，并与单宁酸/铁配合物形成复合纳米材料。
3、本发明的一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料的制备方法，包括：
4、(1)将对羧基苯磺酰胺bs进行活化，得到活化的bs；将活化的bs、第五代聚酰胺-胺树状大分子g5.nh2溶液混合，搅拌反应、透析，冷冻干燥得到对羧基苯磺酰胺修饰的树状大分子g5.nh2-bs；
5、(2)将g5.nh2-bs的水溶液、铜源溶液混合，超声反应、超滤，得到对羧基苯磺酰胺修饰的树状大分子铜络合物cu(ⅱ)/g5-bs溶液；
6、(3)将cu(ⅱ)/g5-bs溶液、碱液、h2o2溶液混合，搅拌反应，超滤，得到对羧基苯磺酰胺修饰的树状大分子包裹的过氧化铜复合物cuo2/g5-bs溶液；
7、(4)将铁源溶液、cuo2/g5-bs溶液、单宁酸ta溶液混匀，超滤，得到负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米平台cuo2/g5-bs/tf。
8、上述制备方法的优选方式如下：
9、所述步骤(1)混合方式：活化的bs逐滴加入到剧烈搅拌的第五代聚酰胺-胺树状大分子g5.nh2溶液中。
10、所述步骤(1)中活化：将对羧基苯磺酰胺bs溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc-hcl和n-羟基琥珀酰亚胺nhs活化；其中edc、nhs、bs的摩尔比90-110:90-110:18-22。
11、所述活化反应时间为2-4h；所述溶剂为二甲基亚砜dmso。
12、所述步骤(1)中bs与g5.nh2的摩尔比18-22:0.9-1.1；溶液采用的溶剂为二甲基亚砜dmso；所述搅拌反应温度为室温，反应时间为23-25h。
13、所述步骤(2)中混合方式为：g5.nh2-bs溶解在水中，加入cucl2溶液。
14、所述步骤(2)中铜源为cucl2；铜源与g5.nh2-bs的摩尔比为38-42:0.9-1.1；所述超声反应时间为20-40min。
15、所述步骤(3)中混合方式：将cu(ⅱ)@g5-bs溶液中加入碱溶液，滴加h2o2溶液。
16、所述步骤(3)中碱液为naoh溶液；所述cu(ⅱ)/g5-bs、naoh、h2o2的摩尔比为0.9-1.1:38-42:398-402；所述cu(ⅱ)@g5-bs、碱与h2o2溶液溶液的溶剂均为水；所述搅拌反应时间为15-35min，进一步地，搅拌时间为25-35min。
17、所述步骤(4)中混合方式：将铁源溶液和cuo2/g5-bs溶液，涡旋混匀，然后再加入单宁酸ta溶液，涡旋混匀。
18、所述步骤(4)中铁源为fecl3；所述ta、铁源与cuo2/g5-bs的摩尔比为28-30:28-30:0.9-1.1；铁源、cuo2/g5-bs、单宁酸ta溶液采用的溶剂均为水。
19、所述步骤(1)的透析为：用截留分子量为3500da的透析袋在超纯水中透析三天，所述步骤(2)、(3)和(4)中的超滤为：用截留分子量为10000da的超滤离心管在5000rpm转速下超滤三次。
20、本发明的一种所述方法制备的负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料。
21、本发明提供一种所述负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料在制备肿瘤的增强型化学动力学治疗和mr成像药物中的应用。
22、本发明首先在树状大分子表面修饰对羧基苯磺酰胺，并以g5-bs作为模板，在其内部包裹了过氧化铜纳米颗粒。最后，负载过氧化铜的树状大分子与单宁酸/铁配合物形成ph响应的复合纳米平台cuo2@g5-bs/tf。
23、本发明使用zeta电势及动态光散射分析(dls)、核磁共振氢谱(1h nmr)、紫外可见吸收光谱(uv-vis)、电感耦合等离子体原子发射光谱(icp-oes)、透射电子显微镜(tem)、核磁共振成像分析仪等手段表征制备的负载过氧化铜树状大分子-单宁酸/铁复合纳米平台的物理及化学性质。通过cck-8分析评价负载药物的纳米材料的细胞毒性；利用icp-oes检测了细胞对材料的吞噬情况；利用gsh和gssg检测试剂盒检测了材料对细胞内的gsh水平的影响；利用激光共聚焦显微镜评价了材料对细胞内的ros水平的影响；利用流式细胞仪检测了细胞凋亡情况。最后建立小鼠皮下肿瘤模型进行磁共振成像和抗肿瘤实验。
24、本发明中第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5表面修饰对羧基苯磺酰胺bs，内部包裹过氧化铜纳米颗粒，并与单宁酸/铁配合物形成复合纳米平台。本发明操作工艺简单，反应条件温和，易于纯化。制备的负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米平台具有稳定性好、低毒、在肿瘤微环境智能释放等优点，并可用于肿瘤mr成像及化学动力学治疗，在诊疗一体化领域具有潜在的应用价值。
25、有益效果
26、(1)本发明工艺简单，成本较低，易于操作分离，且制备的纳米平台具有良好的稳定性、水溶性及生物相容性。
27、(2)本发明制备的纳米平台具有ph响应性，能够在弱酸性tme中释放过氧化铜和单宁酸-铁有效提高芬顿、类芬顿反应效率，增强化学动力学治疗作用。
28、(3)本发明制备的纳米平台通过尾静脉注射进入小鼠体内后，能够主动靶向肿瘤并有效抑制肿瘤生长，可以实现增强型的化学动力学治疗和mr成像，具有潜在临床应用价值。
1.一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料，其特征在于，所述纳米材料以第五代聚酰胺-胺pamam树状大分子g5表面修饰对羧基苯磺酰胺bs，内部包裹过氧化铜纳米颗粒，并与单宁酸/铁配合物形成复合纳米材料。
2.一种负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料的制备方法，包括：
3.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中活化：将对羧基苯磺酰胺bs溶解在溶剂中，加入1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐edc-hcl和n-羟基琥珀酰亚胺nhs活化；其中edc、nhs、bs的摩尔比90-110:90-110:18-22。
4.根据权利要求3所述制备方法，其特征在于，所述活化反应时间为2-4h；所述溶剂为二甲基亚砜dmso。
5.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(1)中bs与g5.nh2的摩尔比18-22:0.9-1.1；溶液采用的溶剂为二甲基亚砜dmso；所述搅拌反应温度为室温，反应时间为23-25h。
6.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(2)中铜源为cucl2；铜源与g5.nh2-bs的摩尔比为38-42:0.9-1.1；所述超声反应时间为20-40min。
7.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(3)中碱液为naoh溶液；所述cu(ⅱ)/g5-bs、碱、h2o2的摩尔比为0.9-1.1:38-42:398-402；所述溶液的溶剂均为水；所述搅拌反应时间为15-35min。
8.根据权利要求2所述制备方法，其特征在于，所述步骤(4)中铁源为fecl3；所述ta、铁源与cuo2/g5-bs的摩尔比为28-30:28-30:0.9-1.1；溶液采用的溶剂均为水。
9.一种权利要求1所述负载过氧化铜的树状大分子-单宁酸/铁复合纳米材料在制备肿瘤的增强型化学动力学治疗和mr成像药物中的应用。
