本发明涉及核酸合成领域，具体涉及一种筛选序列正确的dna分子的方法及其应用。
背景技术：
1、目前业内已有共识：基因合成的成本一直居高不下。虽然短片段合成技术在近年来有了很多突破，但将它们准确、低成本地拼接为长基因并且获得序列无误的质粒依然是行业内未解决的难题。
2、当前，全基因合成主流技术仍是由化学合成法合成短的oligo dna(一般≤120nt)，然后oligo dna通过taq dna聚合酶、pfu dna聚合酶等拼接为长的双链dna(如图8所示)。
3、受限于化学合成方法，oligo dna分子中包含有较多的突变，这些突变将会被带入到由oligo拼接而成的双链dna分子中。即拼接而成的dna产物中包含有完美dna分子(与预期序列完全一致、序列正确的dna分子，下同)和错误的dna分子(与预期序列不完全一致，下同)。随着拼接而成的dna越长，错误分子的占比越高，完美分子的占比越低。
4、在实际生产中，在不进行纠错处理的情况下：对于由oligo拼接而成的2000bp的双链dna，后续实验为连载体-转化-涂板-菌落pcr-阳性克隆测序，测序正确率约为8/24，即挑24个单克隆测序仅有8个完美分子；而对于拼接而成的4000bp的双链dna，后续实验为连载体-转化-涂板-菌落pcr-阳性克隆测序，测序正确率约为5/48，即挑48个单克隆测序仅有5个完美分子。这将会导致测序成本大大增加，也使得基因合成的成本居高不下。
5、因此，本领域亟需一种低成本、快速的筛选序列正确的dna分子的方法。
技术实现思路
1、如前所述，本领域亟需一种低成本、快速的筛选序列正确的dna分子的方法。
2、本发明人通过稀释dna溶液、分管扩增、测序筛选出序列正确的完美dna分子，并且将该方法应用于合成较长的目的dna序列中，在oligo拼接为双链dna后，将完美分子筛选出来，剔除错误分子，再进行后续实验。
3、在第一方面，本发明提供了一种筛选序列正确的dna分子的方法，所述方法包括以下步骤：
4、(1)稀释含有多个拷贝的dna溶液；
5、(2)将稀释后的dna溶液等量分管进行扩增；
6、(3)对扩增产物进行测序；
7、(4)对测序结果进行序列比对，筛选出序列正确的dna分子。
8、在第二方面，本发明提供了第一方面所述的方法的应用，包括使用所述正确的dna分子合成目的dna序列。
9、在第三方面，本发明提供了一种合成目的dna序列的方法，所述方法包括以下步骤：
10、(1)获得目的dna序列；
11、(2)将所述目的dna序列拆分为多个寡聚核苷酸，设计所述多个寡聚核苷酸的引物序列，化学合成所述多个寡聚核苷酸；
12、(3)利用pcr技术将合成的所述多个寡聚核苷酸合成为双链dna，获得含有多个拷贝的dna溶液；
13、(4)稀释含有多个拷贝的dna溶液；
14、(5)将稀释后的dna溶液等量分管进行扩增；
15、(6)筛选出含有扩增子的扩增产物，对含有扩增子的扩增产物进行测序；
16、(7)对测序结果进行序列比对，筛选出序列正确的dna分子用于合成所述目的dna序列。
17、本发明的有益效果包括：
18、利用本发明提供的方法，搭配全自动移液工作站，可大幅减少由转化子筛选、测序等带来的人工成本和试剂成本。
1.一种筛选序列正确的dna分子的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中使用te缓冲液稀释dna溶液。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(1)中将dna溶液稀释至小于等于40拷贝/200μl的浓度，优选10-30拷贝/200μl的浓度，更优选20拷贝/200μl的浓度。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)中的分管数为40。
5.权利要求1-4中任一项所述的方法的应用，包括使用所述正确的dna分子合成目的dna序列。
6.一种合成目的dna序列的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(3)中的双链dna的长度为2000bp。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，步骤(4)中使用te缓冲液稀释dna溶液。
9.根据权利要求6-8中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(4)中将dna溶液稀释至20拷贝/200μl的浓度。
10.根据权利要求6-9中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(5)中的分管数为40。
