本发明属于医药领域，具体涉及一种促进血管再生的酸响应纳米材料及其制备方法。
背景技术：
1、血管是人体重要的器官之一，它承担着运输氧气、血液以及人体中所需营养物质的重要任务，并参与调节人体的代谢平衡。血管系统障碍会引发一系列的缺血性疾病，如缺血性心脏病和下肢缺血。缺血性心脏病患病率逐年持续上升，并且由于其高致残率和高致死率，已经成为全球性健康问题。缺血性心脏病是由冠状动脉阻塞后心肌梗死引起的，血管阻塞后血管中的血流和氧气减少进而使心肌细胞缺血性坏死，产生梗塞区域并导致心肌的收缩能力下降，最终形成纤维化疤痕而影响心脏功能。下肢缺血是由于动脉狭窄或闭塞导致的，下肢供血不足会使患者出现缺血性疼痛、组织溃疡或坏疽等临床症状，长期的缺血会导致患者下肢坏死以至截肢。治疗缺血性疾病的最有效办法就是对缺血部位坏死的血管进行重建。目前临床上可以利用手术搭桥和血管形成术来重建血管，但是符合手术条件的患者很少，并且术后感染依然是患者面临的一大挑战，因此，开发一种新型无创高效促进血管再生的治疗方法迫在眉睫。
2、间充质干细胞的组织再生能力为新血管形成提供了一种新的途径，间充质干细胞(msc)治疗缺血性疾病主要依托其强大的旁分泌能力。msc旁分泌各种细胞因子如血管内皮生长因子(vegf)、胰岛素样生长因子(igf-1)、表皮生长因子(egf)来刺激血管内皮细胞的增殖和分化；msc旁分泌的肝细胞生长因子(hgf)通过调节基质金属蛋白酶(mmps)和基质金属蛋白酶抑制剂(timps)来抑制成纤维细胞活化，减少胶原等ecm沉积。近些年，已经有许多实验证明msc具有治疗缺血性疾病的潜力，但单纯的msc移植存在移植后存活率低、靶向性差等问题。缺氧诱导因子-1(hif-1α)在缺氧条件下能够高表达，诱导包括vegf、sdf-1、igf-1、血小板衍生生长因子(pdgf)和一氧化氮合酶(inos)等促血管新生相关基因的表达，促进血管的新生、抑制纤维化、减少细胞凋亡，促进组织修复，但在常氧条件下，细胞内的hif-1α容易分解，因此可以通过上调msc中hif-1α的表达来提升msc旁分泌效果，进一步促进血管再生。
3、随着纳米药物递送系统研究的深入，尤其与msc联合治疗疾病，弥补了msc移植疗法的缺陷。聚乳酸-羟基乙酸共聚物(plga)是美国fda和欧洲药品管理局批准用于药物递送的高分子化合物，具有很好的生物安全性，是药物递送中理想的纳米载体。研究证明在plga纳米颗粒(plga-nps)表面涂覆红细胞膜(rbc)，不仅可以增强nps的生物相容性，还可以延长纳米颗粒在血液中的循环时间。使用细胞膜涂层技术可以赋予纳米载体的独特特性，有时可能也需要将多种细胞类型的功能结合到单个纳米颗粒上。目前的研究中plga纳米颗粒主要依靠其自身的缓慢降解来释放药物，往往释放速度比较慢。如何提高plga纳米颗粒的药物释放速度是其应用于药物递送中亟待解决的问题。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种促进血管再生的酸响应纳米材料。
2、本发明所提供的促进血管再生的酸响应纳米材料，包括：聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga纳米颗粒，负载在plga纳米颗粒内部的转染hif-1α的msc条件培养基和酸响应因子cg-co2，以及包覆在plga纳米颗粒表面的红细胞膜和血小板膜，
3、其中，cg-co2表示壳聚糖胍基-二氧化碳；
4、所述转染hif-1α的msc条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：利用慢病毒作为载体向msc中转染hif-1α质粒并对msc进行缺氧处理，促进hif-1α高表达，得到含生长因子的条件培养基，
5、具体操作如下：hek-293t细胞长至80％汇合度时，除去原有含血清的培养基，用pbs洗涤细胞后加入不含血清的dmem基础培养基，放入培养箱中备用；取polybrene加入到opti-mem中，另外将pspax2、pmd2.g及hif-1ɑ质粒混匀后加入到opti-mem中，放置1-10min后将二者混合，室温再放置10-30min后加入到hek-293t细胞中；1-24h后将培养基换成含血清的dmem基础培养基，24-72h后收集培养基，离心后弃去沉淀，将上清过滤，所得滤液即为慢病毒悬液；将脂肪来源间充质干细胞长至70％-90％汇合度后除去原有含血清的培养基，pbs洗涤后加入慢病毒悬液，培养12-24h(具体可为24h)，弃去慢病毒悬液，pbs洗涤，加入无血清的dmem基础培养基，低氧培养1-5天(具体可为5天)，得到含生长因子的条件培养基；
6、所述脂肪来源间充质干细胞为传代至p5代的脂肪来源间充质干细胞。
7、所述酸响应因子cg-co2通过包括如下步骤的方法制备得到：将壳聚糖溶于水中，氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸溶于乙腈中，混合，惰性气氛中反应，得到cg固体；将二氧化碳通入cg水溶液中，得到cg-co2，
8、其中氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的结构式如下所示：
9、
10、制备所述酸响应因子cg-co2的方法中，反应完全后旋蒸除去溶剂，将旋蒸后的固体重新溶于水中，搅拌下加入四氢呋喃，抽滤除去thf，将得到的固体干燥，得到cg固体，
11、所述壳聚糖的分子量可为1-10kda，具体可为3kda；
12、壳聚糖与氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸的质量比可为1-5mg:1mg，具体可为8mg:5mg；
13、所述反应的时间可为1-36h，具体可为20-30h，更具体可为24h；
14、所述cg水溶液中cg的浓度可为1-5mg/ml，通二氧化碳的时间可为1-5h，具体可为1h。
15、上述促进血管再生的酸响应纳米材料通过包括如下步骤的方法制备得到：
16、将二棕榈酰磷脂酰胆碱dppc和聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga溶于二氯甲烷中，加入转染hif-1α的msc条件培养基和cg-co2，超声乳化，将乳化好的溶液加入到胆酸钠溶液中，超声，将得到的乳液加入到胆酸钠溶液中，固化并去除有机溶剂，得到负载转染hif-1α的msc条件培养基和酸响应因子cg-co2的plga纳米颗粒，加入红细胞膜和血小板膜，挤出使得红细胞膜和血小板膜包覆到plga纳米颗粒表面，得到酸响应纳米材料。
17、上述方法中，所述dppc与plga、条件培养基、cg-co2中cg的配比依次可为50-100mg:50-100mg：10-50μl：0.01-0.05mg；
18、所述超声乳化通过功率为20％的细胞破碎仪实现，超声乳化的时间可为5min；
19、负载转染hif-1α的msc条件培养基和酸响应因子cg-co2的plga纳米颗粒与红细胞膜和血小板膜的配比可为1ml：1-5μg：1-5μg，具体可为1ml：5μg：5μg。
20、上述酸响应纳米材料在制备促进血管再生的产品中的应用也属于本发明的保护范围。
21、所述应用中，所述促进血管再生的产品用于促进缺血部位的血管再生，主要用于治疗缺血性疾病(包括缺血性心脏病和下肢缺血)。
22、本发明首先利用慢病毒作为载体向msc中转染hif-1α质粒并对msc进行缺氧处理，促进hif-1α高表达，显著提高msc的旁分泌功能，尤其是促血管新生因子的表达；另外，依据缺血部位的低ph水平以及plga纳米颗粒被细胞摄取后进入溶酶体后处于酸性环境这两个特点，制备可以酸响应引发炸弹效应而释放药物的plga纳米颗粒，实现药物递送系统在细胞内快速释放。具体来说是，将转染hif-1α的msc条件培养基与酸响应因子cg-co2一起负载到plga纳米颗粒中制备成酸响应的纳米炸弹，利用cg-co2的酸响应特性实现促血管生成活性因子的快速释放，促进血管的新生、减少炎症反应，从而达到快速治疗缺血性疾病的目的。
23、本发明发展一种基于hif-1α调控msc旁分泌促血管生成活性因子的纳米药物递送系统，并具备以下特性：1.进入病灶部位后实现酸响应的炸弹效应快速释放药物；2.msc高表达血管生成生物活性因子；3.增强靶向缺血部位的能力。
1.一种酸响应纳米材料包括：聚乳酸-羟基乙酸共聚物plga纳米颗粒，负载在plga纳米颗粒内部的转染hif-1α的msc条件培养基和酸响应因子cg-co2，以及包覆在plga纳米颗粒表面的红细胞膜和血小板膜；
2.根据权利要求1所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述转染hif-1α的msc条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：利用慢病毒作为载体向msc中转染hif-1α质粒并对msc进行缺氧处理促进hif-1α高表达，得到含生长因子的条件培养基。
3.根据权利要求2所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述转染hif-1α的msc条件培养基通过包括如下步骤的方法制备得到：hek-293t细胞长至80％汇合度时，除去原有含血清的培养基，用pbs洗涤细胞后加入不含血清的dmem基础培养基，放入培养箱中备用；取polybrene加入到opti-mem中，另外将pspax2、pmd2.g及hif-1ɑ质粒混匀后加入到opti-mem中，放置1-10min后将二者混合，室温再放置10-30min后加入到hek-293t细胞中；1-24h后将培养基换成含血清的dmem基础培养基，24-72h后收集培养基，离心弃去沉淀，将上清过滤，所得滤液即为慢病毒悬液；将脂肪来源间充质干细胞长至70％-90％汇合度后除去原有含血清的培养基，pbs洗涤后加入慢病毒悬液，培养12-24h，弃去慢病毒悬液，pbs洗涤，加入无血清的dmem基础培养基，低氧培养1-5天，得到含生长因子的条件培养基。
4.根据权利要求1所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述酸响应因子cg-co2通过包括如下步骤的方法制备得到：将壳聚糖溶于水中，氨基亚氨基硫代甲基氢碘酸溶于乙腈中，混合，惰性气氛中反应，得到cg固体；将二氧化碳通入cg水溶液中，得到cg-co2溶液，
5.根据权利要求4所述的酸响应纳米材料，其特征在于，所述壳聚糖的分子量为1-10kda；
6.制备权利要求1-5中任一项所述的酸响应纳米材料的方法，包括如下步骤：
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述dppc与plga、条件培养基、cg-co2中cg的配比依次为50-100mg:50-100mg：10-50μl：0.01-0.05mg；
8.权利要求1-5中任一项所述的酸响应纳米材料在制备促进血管再生的产品中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进血管再生的产品用于促进缺血部位的血管再生。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述促进血管再生的产品用于治疗缺血性疾病。
