本发明属于分子生物学，具体涉及一种高效检测cyp2d6拷贝数变异的方法。
背景技术：
1、药物基因组学(pharmacogenomics)是20世纪90年代在遗传学、基因组学、遗传药理学基础上发展起来的一门新兴的交叉学科，主要研究人类基因组信息与药物反应之间的关系，利用基因组学信息解答不同个体对同一药物反应上存在差异的原因，以实现个体化治疗的目的。根据目前的研究结果来看，药物-基因的相关性远高于疾病-基因的相关性，这可能与更少遇到演化压力的缘故。截至2020年9月，fda在298种药物的药物标签标注了药物基因组学信息，且有80多种药物的临床指南中，包含了药物基因组学的建议。
2、细胞色素p450家族酶是一类主要存在于肝脏、肠道中的单加氧酶，多位于细胞内质网上，催化多种内、外源物质的(包括大多数临床药物)代谢，是多种药物化合物代谢的关键决定因素。cyp2d6同工酶参与20％常用药物的代谢，包括用于镇痛、肿瘤、精神疾病、心血管疾病、舞蹈病和戈谢病的药物，这种酶由高度多态性的cyp2d6基因编码，cyp2d6同工酶活性较少受到诱导或者抑制，个体间差异主要与基因型相关。cyp2d6基因型可分为无功能、功能下降、功能正常或功能增加。个体中存在的等位基因的组合(也称为基因型或双倍型)可以预测代谢者表型，范围从代谢不良(pm，无酶活性)到超快速代谢者(um，酶活性增加)。与正常代谢者(nm)表型相比，代谢者不良者和中间代谢者(im)的酶活性降低。酶活性增加通常是由于基因拷贝数变异，即存在一个或多个功能基因拷贝。酶活性显著降低的情形之一为cyp2d6基因的缺失，包括单基因缺失和纯合缺失。
3、cyp2d6为cyp2d家族唯一有功能的基因，同时还有2个假基因，分别为cyp2d7和cyp2d8p，其中cyp2d7与cyp2d6基因高度相似，在基因的前端存在终止密码子导致无法表达，cyp2d7也存在多拷贝情况，cyp2d8p与cyp2d6基因的相似度低一些，目前研究认为是稳定的二倍体。cyp2d6基因结构多变，大多数cyp2d6*等位基因由单核苷酸突变或小插入/缺失定义，还可以携带拷贝数变异(copy number variation cnv)以及与附近的cyp2d7假基因的基因转换，导致cyp2d6-2d7和cyp2d7-2d6杂交等位基因。cyp2d6基因的cnv改变，可能导致酶活性上调或下降的情况，需要注意的是cyp2d6-2d7和cyp2d7-2d6杂交等位基因无法转录出有活性的酶。因此，检测cyp2d6基因的cnv情况，对确定等位基因型别起到重要的识别意义。
4、目前市面上有多种检测cyp2d6 cnv的方法，包括qpcr、核酸质谱、ngs等等，其中以qpcr方法应用最为广泛，以高度保守的管家基因作为二倍体参照，检测cyp2d6特异性基因片段，以确定为cyp2d6二倍体的样本为参照，计算基因的相对含量。常用的管家基因包括gapdh、β-actin、18srna、b2m、hprt和tbp等，常用于rna提取和检测的稳定性研究。在实践中发现，由于管家基因在染色体上分布分散，其扩增子的扩增效率与cyp2d6基因片段的扩增效率一致性存在一定的差异，可能会导致在不同的浓度情况下，拷贝数检出差异。目前实验室多用cyp2d6二倍体的临床样本作为参照物进行cyp2d6基因相对量计算，由于参照物存在个体差异，表达量数值差异较大，需要同时使用5～7个cyp2d6二倍体样本才能保证检测检出准确性，对检出可信度及效率有一定的影响。
5、本发明拟用扩增效率一致的共扩增引物对cyp2d6基因进行检测，选用同时涵盖cyp2d6、cyp2d7和cyp2d8p区段的细菌人工染色体作为参照，使用经典的相对量计算方法对cyp2d6基因的相对量进行计算，减少因扩增引物和参照物差异导致的拷贝数检出误差。
技术实现思路
1、本发明创造性的选择cyp2d6和cyp2d8p基因相似但与cyp2d7基因存在差异的区段，包括intron2、intron6和exon9区域，设计cyp2d6和cyp2d8p共有的扩增引物和独有的检测探针，可同时检出cyp2d6和cyp2d8p基因信号，选择同时覆盖cyp2d6、cyp2d7和cyp2d8p基因的细菌人工染色体dna作为参照，用2-δδct值计算方法，高效获得0～4个cyp2d6区段的拷贝数信息。使用同时覆盖3个基因的细菌人工染色体dna作为参照品，目标基因片段和内参基因的拷贝数恒定为1:1，3个基因间有＞10kb的间距，容易大量制备，且长片段核酸对于降解的抵抗力强，可以较长时间保持核酸完整程度。
2、本发明包括如下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种引物和探针组合，所述引物为针对cyp2d6和cyp2d8p基因共有区段exon9设计的正向引物(cyp2d6-cyp2d8p-f1)和反向引物(cyp2d6-cyp2d8p-r1)；所述探针分别为检测cyp2d6和cyp2d8p基因信号的cyp2d6-probe-6探针和cyp2d6-probe-8探针。
4、具体的，所述引物和探针组合如下表所示：
5、表1引物和探针组合
6、 cyp2d6-cyp2d8p-f1 ttcagcttctcggtgcccac seq id no.1 cyp2d6-cyp2d8p-r1 gcacaaagctcatagggggatg seq id no.2 cyp2d6-probe-6 tcaccaggaaagcaaagacaccatg seq id no.3 cyp2d6-probe-8 tcaccagaaagccgacgacacga seq id no.4
7、优选的，所述cyp2d6-probe-6探针和cyp2d6-probe-8探针的5’端连接不同的报告荧光基团，所述报告荧光基团选自fam、rox、vic、hex、joe、tex或cy5，所述探针的3’端标记淬灭荧光基团，所述淬灭荧光基团为bhq1、nfq或mgb。
8、在本发明的具体实施方式中，cyp2d6-probe-6探针的5’端连接的报告荧光基团为fam，cyp2d6-probe-8探针的5’端连接的报告荧光基团为rox，所述探针的3’端标记的淬灭荧光基团为bhq1。
9、第二方面，本发明提供一种所述引物和探针组合在制备用于检测cyp2d6拷贝数变异(cnv)试剂盒中的用途。
10、第三方面，本发明提供一种试剂盒，所述试剂盒中包括如上所述的引物和探针组合。
11、优选的，所述试剂盒中还包括参照基因，所述参照基因选自rp11-65i14质粒、rp11-142e17质粒、rp11-974d12质粒或rp11-1068c1质粒。本发明选择的参照基因是位于22q13.2区段的可以覆盖到cyp2d6、cyp2d7、cyp2d8p基因的细菌人工染色体dna。本发明选择同时覆盖3个基因的细菌人工染色体dna作为参照品的优势在于：目标基因片段和内参基因的拷贝数恒定为1:1，3个基因间有＞10kb的间距，容易大量制备，且长片段核酸对于降解的抵抗力强，可以较长时间保持核酸完整程度；所述参照品属于大量易得的细菌人工染色体dna，不容易出现变异和批间差。
12、在本发明的具体实施方式中，所述参照基因为rp11-65i14质粒。
13、进一步，所述试剂盒中还包括进行荧光定量pcr的其他本领域技术人员熟知的试剂。
14、在本发明的具体实施方式中，所述试剂包括animal detection u+probe qpcrsuper premix、超纯水。
15、第四方面，本发明提供一种非诊断目的检测cyp2d6拷贝数变异的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
16、(1)提取检测样本dna；
17、(2)配置含有上述引物探针组合的反应液，以步骤(1)提取的dna为模板，进行实时定量荧光pcr检测；
18、(3)以rp11-65i14质粒作为参照基因，用2-δδct值计算方法获得cyp2d6区段的拷贝数信息。
19、在本发明的具体实施方式中，步骤(1)所述的提取检测样本dna可根据本领域技术人员常规操作方法对检测样本中的dna进行提取，如使用dna提取试剂盒。
20、优选的，步骤(2)中所述的引物探针组合终浓度如下表所示：
21、表2引物探针组合浓度
22、 名称 序列 终浓度/nm cyp2d6-cyp2d8p-f1 ttcagcttctcggtgcccac 200-400 cyp2d6-cyp2d8p-r1 gcacaaagctcatagggggatg 200-400 cyp2d6-probe-6 fam-tcaccaggaaagcaaagacaccatg-bhq1 100-200 cyp2d6-probe-8 rox-tcaccagaaagccgacgacacga-bhq1 100-200
23、进一步，步骤(2)所述的实时定量荧光pcr反应体系如下表所示：
24、表3实时定量荧光pcr反应体系
25、 组分 用量 animal detection u+probe qpcr super premix 12.5μl 表2所示的引物探针组合 2.2μl dna模板 2μl <![cdata[h<sub>2</sub>o]]> 补足至25μl
26、更进一步的，步骤(2)所述的实时定量荧光pcr扩增程序如下表所示：
27、表4实时定量荧光pcr扩增程序
28、
29、
30、优选的，步骤(3)所述的2-δδct值计算方法包括如下步骤：
31、a)δct计算：计算每个样本的δct值，用cyp2d6基因的ct值-cyp2d8p基因的ct值，获得δct(d6-8p)＝ct(cyp2d6)-ct(cyp2d8p)。
32、b)δδct计算：计算样本与质粒的δδct值，待检样本的δct(d6-8p)-质粒的δct(d6-8p)，获得δδctcyp2d6(sample-质粒)＝δctsample(d6-8p)-δct质粒(d6-8p)。
33、c)相对量计算：计算样本2^(-δδctcyp2d6(sample-质粒))×2，获得cyp2d6基因目标区段的相对量。
34、上述计算方法中涉及的“质粒的δct(d6-8p)”是根据本发明提供的检测cyp2d6拷贝数变异的方法，将上述表3中的dna模板替换为相同基因模板含量及体积的rp11-65i14质粒，进行实时定量荧光pcr扩增，获得cyp2d6基因的ct值和cyp2d8p基因的ct值，两者相减得到δct质粒(d6-8p)。
35、本发明提供的检测cyp2d6拷贝数变异的方法具有如下优势：
36、本发明构建的扩增体系，选择合适的区段以cyp2d8p基因为内参，同时检测cyp2d6基因多个区段的拷贝数，以同时含有cyp2d6、cyp2d7和cyp2d8p基因片段的细菌人工染色体dna作为参照基因，对覆盖的cyp2d6基因区段进行相对定量以推导cyp2d6基因个数。本发明选择的参照基因属于大量易得的细菌人工染色体dna，不容易出现变异和批间差。
1.引物和探针组合，所述引物为针对cyp2d6和cyp2d8p基因共有区段exon9设计的正向引物和反向引物；所述探针分别为检测cyp2d6和cyp2d8p基因信号的探针。
2.根据权利要求1所述的引物和探针组合，其特征在于，所述引物和探针组合如下表所示：
3.根据权利要求2所述的引物探针组合，其特征在于，cyp2d6-probe-6探针的5’端连接的报告荧光基团为fam，cyp2d6-probe-8探针的5’端连接的报告荧光基团为rox，所述探针的3’端标记的淬灭荧光基团为bhq1。
4.权利要求1所述引物和探针组合在制备用于检测cyp2d6拷贝数变异试剂盒中的用途。
5.试剂盒，所述试剂盒中包括如上所述的引物和探针组合。
6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括参照基因，所述参照基因选自rp11-65i14质粒、rp11-142e17质粒、rp11-974d12质粒或rp11-1068c1质粒；所述试剂盒中还包括荧光定量pcr需要的本领域技术人员熟知的试剂。
7.一种非诊断目的检测cyp2d6拷贝数变异的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的引物探针组合终浓度如下表所示：
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述的实时定量荧光pcr反应体系如下表所示：
10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(3)所述的2-δδct值计算方法包括如下步骤：
