本发明涉及生物酶和基因工程，具体涉及一种m-mlv逆转录酶突变体及其制备方法与应用。
背景技术：
1、逆转录酶是以rna为模板指导三磷酸脱氧核苷酸合成互补dna(cdna)的dna聚合酶，具有三种酶活性的多功能酶，包括rna和dna依赖性的dna聚合酶活性，以及催化rna-dna杂合链中rna降解的rnase h活性。在生物医学领域，逆转录酶被广泛用于病毒rna检测、基因表达与功能分析、cdna文库制备、rna测序、微阵列分析、race等等方面，是应用最为广泛的生物医药工具酶之一。
2、但是，目前行业内的m-mlv逆转录酶在进行逆转录体系反应的时候活性不高、所以如何构建和制备一种新型的m-mlv逆转录酶，使m-mlv逆转录酶活性提高，是本行业研究的热点和难点。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供一种m-mlv逆转录酶突变体及其制备方法与应用。
2、第一方面，本发明要求保护一种m-mlv逆转录酶突变体。
3、本发明所要求保护的m-mlv逆转录酶突变体为将野生型m-mlv逆转录酶的氨基酸序列的第69位的苯丙氨酸突变为亮氨酸(f69l)，第288位的苯丙氨酸突变为赖氨酸(f288k)，第326位的甘氨酸突变为脯氨酸(g326p)后所得。
4、进一步地，所述m-mlv逆转录酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
5、第二方面，本发明要求保护编码前文第一方面中所述的m-mlv逆转录酶突变体的核酸分子。
6、所述核酸分子可以是dna，如cdna、基因组dna或重组dna；所述核酸分子也可以是rna，如mrna等。
7、进一步地，所述核酸分子可为如下任一：
8、(a1)seq id no.2所示的dna分子；
9、(a2)在严格条件下与(b1)限定的dna分子杂交且编码所述m-mlv逆转录酶突变体的dna分子；
10、(a3)与(b1)-(b2)中任一限定的dna序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述m-mlv逆转录酶突变体的dna分子。
11、上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(sds)、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，2×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5mna3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；还可为：50℃，在7％sds、0.5m na3po4和1mm edta的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×ssc，0.1％ sds中漂洗；也可为：在6×ssc，0.5％ sds的溶液中，在65℃下杂交，然后用2×ssc，0.1％ sds和1×ssc，0.1％ sds各洗膜一次。
12、上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如ncbi主页网站的blast网页。例如，可在高级blast2.1中，通过使用blastp作为程序，将expect值设置为10，将所有filter设置为off，使用blosum62作为matrix，将gap existence cost，per residue gap cost和lambda ratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。
13、上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。
14、第三方面，本发明要求保护含有前文第二方面中所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
15、所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达所述核酸分子(即所述突变型taq酶的编码基因)的dna，该dna不但可包括启动所述编码基因转录的启动子，还可包括终止所述编码基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
16、上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。
17、上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(escherichia)，欧文氏菌(erwinia)，根癌农杆菌属(agrobacterium)(如根癌农杆菌eha105)，黄杆菌属(flavobacterium)，产碱菌属(alcaligenes)，假单胞菌属(pseudomonas)，芽胞杆菌属(bacillus)等。
18、在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pet-28a载体的多克隆位点后所得。
19、进一步地，所述重组微生物为将前文所述的重组载体导入到大肠杆菌后所得。
20、在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌为bl21(de3)。
21、第四方面，本发明要求保护一种制备前文第一方面中所述m-mlv逆转录酶突变体的方法。
22、本发明要求保护的制备前文第一方面中所述m-mlv逆转录酶突变体的方法，可包括如下步骤：
23、(b1)构建含有前文第二方面所述核酸分子的表达载体；
24、(b2)将步骤(b1)的表达载体转化至宿主细胞，获得重组细胞；
25、(b3)培养步骤(b2)的重组细胞，诱导表达重组蛋白，纯化得到所述m-mlv逆转录酶突变体。
26、其中，步骤(b1)可以采用先合成编码上述m-mlv逆转录酶突变体的核酸分子，再将所述核酸分子插入到合适的表达载体中，也可通过pcr直接得到包含所述m-mlv逆转录酶突变体的编码基因的质粒。
27、进一步地，在(b1)中，所述表达载体为原核表达载体。在本发明的具体实施方式中，所述重组载体为将所述核酸分子克隆到pet-28a载体的多克隆位点后所得。
28、在(b2)和(b3)中，在适当条件下培养含有所述m-mlv逆转录酶突变体的编码基因的宿主细胞，并采用分子生物学的方法，从工程改造的宿主细胞中分离本技术的m-mlv逆转录酶突变体，使其与宿主细胞的其他组分，如蛋白质，糖或脂质分开。这类方法包括但不限于：分子大小排阻层析，硫酸铵分级，离子交换层析，亲和层析和制备行凝胶电泳。
29、进一步地，在(b2)中，所述宿主细胞为大肠杆菌。在本发明的具体实施方式中，所述大肠杆菌为bl21(de3)。
30、进一步地，在(b3)中，加入终浓度为0.4mmol/l的异丙基硫代半乳糖苷(iptg)进行诱导表达，37℃诱导4小时，4℃7000r/min离心10min收集菌体。将发酵菌泥(即收集的菌体)高压均质破碎，离心过滤处理，上16/10hi-prep肝素ff柱(amersham pharmacia biotech)纯化获得所述m-mlv逆转录酶突变体。
31、第五方面，本发明要求保护一种逆转录酶试剂。
32、本发明所要求保护的逆转录酶试剂中含有前文第一方面所述的m-mlv逆转录酶突变体。
33、进一步地，所述逆转录酶试剂中还可含有4×反应缓冲液。所述4×反应缓冲液组成如下：250mm tris，375mm kcl，15mm mgcl2，50mm mgso4,50mm nacl，体积百分含量为0.05‰的过饱和酚红溶液，质量分数为10％的peg8000(聚乙二醇)，0.50mm dtt。上述各组分的浓度均为在所述4×反应缓冲液中的终浓度，其余为水。
34、第六方面，本发明要求保护前文第一方面中所述的m-mlv逆转录酶突变体或前文第五方面中所述的逆转录酶试剂在进行逆转录反应中的应用。
35、第七方面，本发明要求保护一种对模板rna进行逆转录的方法。
36、本发明所要求保护的对模板rna进行逆转录的方法，可包括如下步骤：
37、(c1)配制退火反应体系并进行退火反应，得到退火产物；
38、所述退火反应体系中含有模板rna、rt引物和dntp；所述rt引物为seq id no.4所示单链dna；
39、(c2)配制逆转录反应体系并进行逆转录反应；
40、所述逆转录反应体系为10μl体系；所述10μl体系组成如下：6μl所述退火产物、2.5μl前文所述4×反应缓冲液、0.5μl tso引物(75μm)、1μl前文所述m-mlv逆转录酶突变体；所述tso引物为seq id no.5所示单链dna；
41、进行所述逆转录反应的程序为：42℃90min，85℃5min，4℃保温。
42、进一步地，步骤(c1)中，进行所述退火反应的程序为：70℃，5min，热盖≥85℃；4℃保温(时间＜30min)。
43、在第六方面和第七方面中，所述逆转录酶具体可应用于合成cdna、制作cdna探针与rna转录、cdna文库制备、rna测序等方面。
44、本发明突变野生型m-mlv逆转录酶的关键位点的氨基酸，从而改变m-mlv逆转录酶的活性，本发明提高了m-mlv逆转录酶的活性。
45、本发明提高扩增效率，对合成优质的cdna具有重要作用，对遗传工程技术的提升有重要意义。
1.一种m-mlv逆转录酶突变体，其特征在于：所述m-mlv逆转录酶突变体为将野生型m-mlv逆转录酶的氨基酸序列的第69位的苯丙氨酸突变为亮氨酸，第288位的苯丙氨酸突变为赖氨酸，第326位的甘氨酸突变为脯氨酸后所得。
2.根据权利要求1所述的m-mlv逆转录酶突变体，其特征在于：所述m-mlv逆转录酶突变体的氨基酸序列如seq id no.3所示。
3.编码权利要求1或2所述的m-mlv逆转录酶突变体的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的核酸分子，其特征在于：所述核酸分子为如下任一：
5.含有权利要求3或4所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。
6.一种制备权利要求1或2所述m-mlv逆转录酶突变体的方法，包括如下步骤：
7.一种逆转录酶试剂，其特征在于：所述逆转录酶试剂中含有权利要求1或2所述的m-mlv逆转录酶突变体。
8.根据权利要求7所述的逆转录酶试剂，其特征在于：所述逆转录酶试剂中还含有4×反应缓冲液；
9.权利要求1或2所述的m-mlv逆转录酶突变体或权利要求7或8所述的逆转录酶试剂在进行逆转录反应中的应用。
10.一种对模板rna进行逆转录的方法，包括如下步骤：
