本发明涉及一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用，属于生物医药领域。
背景技术：
1、近年来，核酸类药物治疗技术飞速发展。核酸作为一种新型生物药物，可以调控基因表达或产生治疗性蛋白质，能够特异性治疗多种疾病，包括传染病、癌症、免疫疾病和孟德尔疾病(包括神经系统疾病)等。然而，相较于许多小分子和蛋白质药物，裸核酸分子极易被核酸酶破坏降解，并被肾脏迅速清除，同时核酸分子具有亲水性、负电性和高分子量等理化性质，导致其难以穿过细胞膜到达作用位点。因此，核酸药物开发和应用的主要难点在于递送技术。递送系统的开发将解决核酸在体内递送存在的诸多问题，是提高核酸药物疗效的关键。
2、在病毒性传染病流行的背景下，以脂质纳米颗粒(lnp)为递送载体的mrna疫苗快速投入到大量生产和使用中。这使得人们看到了脂质纳米颗粒核酸递送系统的应用价值及巨大潜力。在过去的几年中，核酸递送系统已经取得了巨大的进步，但只有少数核酸药物成功上市。大部分原因在于递送过程中存在许多生物学障碍，药物载体难以同时保证低毒性以及高递送效率。因此一种能够提高递送效率同时具有生物安全性的递送载体亟待开发。
3、目前，已有研究使用含有阳离子脂质组分的lnp来递送核酸药物，以增强细胞摄取来提高转染效率，然而由于其与核酸分子结合过于紧密，导致核酸分子在细胞质中难以被释放出来，进而难以发挥作用，且过于集中的正电荷具有细胞毒性，因此现有的lnp递送技术还需进一步优化。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的问题，本发明提供一种脂质纳米颗粒、阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统及其制备与应用。本发明脂质纳米颗粒中的可电离脂质分子的制备步骤简单高效、原料简单易得，对设备要求低，反应条件温和，纯化方式简单；所得脂质纳米颗粒用于制备阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，所得核酸递送系统生物安全性高，核酸包封效率高，核酸递送效率高，转染效率佳，能够充分发挥核酸药物的治疗疗效，在肿瘤学、基因治疗等领域都具有广泛应用前景。
2、本发明的技术方案如下：
3、本发明第一方面，提供一种脂质纳米颗粒，包括如下质量百分比的组分：可电离脂质分子40％-80％，聚乙二醇功能化脂质5％-30％，类固醇10-40％。
4、根据本发明优选的，所述可电离脂质分子由烷基丙烯酸酯与胺基烃类经迈克尔加成反应制备得到。
5、优选的，烷基丙烯酯结构中的烷基碳原子数为1-20；优选为丙烯酸十四烷基酯。
6、优选的，胺基烃类结构中的烃基选自饱和或不饱和、支化或未支化的碳原子数为8-20的烃基，胺基烃类结构中的胺基数为1-5。优选的，胺基烃类为精胺、亚精胺、三(2-氨基乙基)胺、1,4-双(3-氨丙基)哌嗪、n,n-双(3-氨丙基)甲胺或n,n-二甲基亚二丙基三胺。最优选的为精胺。
7、优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：1-6。优选的，胺基烃类与烷基丙烯酯的摩尔比为1：5。
8、优选的，可电离脂质分子的制备方法包括步骤：将烷基丙烯酸酯与胺基烃类混合均匀，经迈克尔加成反应得到可电离脂质分子。
9、进一步优选的，加成反应温度为80℃-100℃，反应时间为48-72小时，反应是在搅拌条件下进行的。进一步优选的，加成反应温度为85℃-95℃，反应时间为60-70小时。
10、进一步优选的，加成反应需要避光进行。
11、进一步优选的，加成反应所得反应液的后处理方法包括步骤：将反应液于无水乙醇中透析处理，然后经干燥得到可电离脂质分子。
12、根据本发明优选的，所述可电离脂质分子具有如下所示结构：
13、
14、根据本发明优选的，聚乙二醇功能化脂质选自1,2-二硬脂酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺-n-[氨基(聚乙二醇)-2000]、1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000、d-α琥珀酸生育酚聚乙二醇酯或二棕榈酰磷脂酰乙醇胺-聚乙二醇2000中的一种。优选的，聚乙二醇功能化脂质为1,2-二肉豆蔻酰-rac-甘油-3-甲氧基-聚乙二醇2000。
15、根据本发明优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、谷甾醇、豆甾烷醇、谷甾烷醇、麦角固醇、胆甾烷醇、脱氢胆固醇、二氢胆固醇、羟基胆固醇或岩皂甾醇中的一种。优选的，类固醇选自胆固醇、β-谷甾醇、豆甾醇、豆甾烷醇、麦角固醇或岩皂甾醇中的一种。最优选的，所述类固醇为胆固醇。
16、本发明第二方面，提供一种脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：将可电离脂质分子、聚乙二醇功能化脂质、类固醇溶解于乙醇溶剂中得到脂质预混溶液；在室温、涡旋条件下，将脂质预混溶液滴加至缓冲液中，得到脂质纳米颗粒溶液。
17、根据本发明优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为10-100mg/ml。优选的，脂质预混溶液中，可电离脂质分子的质量浓度为22.3mg/ml。
18、根据本发明优选的，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，所述缓冲液ph为4-6。优选的，缓冲液ph为5.4。
19、根据本发明优选的，脂质预混溶液和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:26。
20、根据本发明优选的，脂质预混溶液匀速逐滴滴加至缓冲液中；滴加完毕后，继续涡旋1-2分钟；室温静置10-30分钟，得到脂质纳米颗粒溶液。
21、根据本发明优选的，脂质纳米颗粒溶液可经干燥得到脂质纳米颗粒。
22、本发明第三方面，提供一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，包括组分：脂质纳米颗粒、阴离子聚合物以及核酸类药物。
23、根据本发明优选的，所述阴离子聚合物选自聚-l-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、聚丙烯酸钠、透明质酸钠、肝素钠、羧甲基纤维素钠盐或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种。优选的，所述阴离子聚合物为聚-l-谷氨酸钠、海藻酸钠、葡聚糖硫酸钠、透明质酸钠、肝素钠或羧甲基葡聚糖钠盐中的一种。更优选的，所述阴离子聚合物为聚-l-谷氨酸钠、葡聚糖硫酸钠或肝素钠中的一种。
24、根据本发明优选的，所述核酸类药物选自信使rna(mrna)、小干扰rna(sirna)、微小rna(microrna)、反义寡核苷酸(aso)、dna或核酸适配体。优选的，所述核酸类药物为绿色荧光蛋白mrna(megfp)或荧光素酶mrna(mfluc)。
25、根据本发明优选的，所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为10-40:1。优选的，所述脂质纳米颗粒与核酸类药物的质量比为30:1。
26、根据本发明优选的，所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.1-20。优选的，所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比为1:0.2-10。所述核酸类药物与阴离子聚合物的电荷比是指：每摩尔核酸类药物所带电荷数与每摩尔阴离子聚合物所带电荷数之比。
27、本发明第四方面，提供上述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，包括步骤：将阴离子聚合物和核酸类药物溶液充分混合均匀，加入脂质纳米颗粒溶液混合均匀，室温静置，得到阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统。
28、根据本发明优选的，核酸类药物溶液的溶剂为无酶水，核酸类药物溶液的质量浓度为0.01-10mg/ml；优选的，核酸类药物溶液的质量浓度为0.1-1mg/ml。
29、根据本发明优选的，脂质纳米颗粒溶液为脂质纳米颗粒的乙醇溶液或脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液；脂质溶液的质量浓度为0.5-2mg/ml；优选的，脂质纳米颗粒溶液的质量浓度为1.25mg/ml。优选的，脂质纳米颗粒的乙醇-缓冲液溶液中，缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液，缓冲液ph为4-6，优选ph为5.4；乙醇和缓冲液的体积比为1：25-35，优选为1:30。
30、根据本发明优选的，室温静置时间为10-30分钟。
31、本发明第五方面，提供上述脂质纳米颗粒在具有预防性或治疗性的核酸递送载体中的应用。
32、本发明第六方面，提供上述脂质纳米颗粒或阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在预防或治疗疾病药物中的应用。
33、本发明第七方面，提供上述脂质纳米颗粒或阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在对象中诱导蛋白质表达的药物中的应用。优选的，所述对象是哺乳动物。
34、根据本发明优选的，所述给药方式包括：静脉注射、肌肉注射、气管给药、皮下注射或口服。
35、本发明的技术特点及有益效果如下：
36、1、本发明可电离脂质分子由烷基丙烯酯和胺基烃类经迈克尔加成所得，原料简单易得，制备步骤简单高效，对设备要求低，反应条件温和，纯化方式简单。烷基丙烯酯优选为十四烷基丙烯酯，胺基烃类优选为精胺，所得到的可电离脂质分子在后续的应用中转染效果最好，递送核酸类药物效果最佳。
37、2、本发明脂质纳米颗粒中，可电离脂质分子，作为脂质纳米颗粒中的核心成分，可促进细胞内吞和内涵体逃逸，从而增强转染效果；类固醇可增强脂质纳米颗粒的稳定性；而聚乙二醇功能化脂质裸露在脂质纳米颗粒表面，通过降低颗粒聚集进一步促进颗粒稳定性，并且可以减少肾脏和单核吞噬细胞系统介导的清除，增强药物的递送效果。故其配方即可电离脂质、类固醇和聚乙二醇功能化脂质三者的种类以及配比关系对药物递送效率具有一定影响。本发明脂质纳米颗粒中，可电离脂质分子、类固醇与聚乙二醇功能化脂质三者种类合适，配比适宜，最后制备出的脂质纳米颗粒才能在后续应用中效果佳。
38、3、本发明阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在递送核酸类药物时具有诸多优点。首先，由于脂质纳米颗粒对核酸类药物具有良好的包封效率以及稳定性，这种系统可以有效地避免核酸药物未到达作用位点即降解的问题，即，使得核酸类药物具有良好的稳定性。其次，通过阴离子电性排斥的作用，可以促进核酸类药物在细胞内的释放，显著提高核酸药物递送效率以及转染效率，能够充分发挥核酸药物的治疗疗效。因此针对提高递送效率与增强转染效果，阴离子聚合物的用量及种类起重要作用。本发明中，当阴离子聚合物用量较少时，核酸递送系统被细胞内吞后，由于阴离子聚合物少，电性斥力弱，有效释放出的mrna少；而当阴离子聚合物用量较多时，由于电性作用过大，导致脂质纳米颗粒对核酸类药物包封效率低，最终递送效果不好。因此阴离子聚合物的用量需适当，以使包封效率较高，转染效果较佳。另外不同的阴离子聚合物对纳米颗粒核酸递送系统也有不同的影响，本发明筛选了一系列阴离子聚合物，其中含有葡聚糖硫酸钠的核酸递送系统在体内外表现最为突出。最后，本发明药物递送系统具有良好的生物安全性。因此，本发明基于阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在肿瘤学、基因治疗等领域都具有广泛应用前景。
1.一种脂质纳米颗粒，其特征在于，包括如下质量百分比的组分：可电离脂质分子40％-80％，聚乙二醇功能化脂质5％-30％，类固醇10-40％。
2.根据权利要求1所述脂质纳米颗粒，其特征在于，所述可电离脂质分子由烷基丙烯酸酯与胺基烃类经迈克尔加成反应制备得到；
3.根据权利要求1所述脂质纳米颗粒，其特征在于，包括以下条件中的一项或多项：
4.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒的制备方法，包括步骤：将可电离脂质分子、聚乙二醇功能化脂质、类固醇溶解于乙醇溶剂中得到脂质预混溶液；在室温、涡旋条件下，将脂质预混溶液滴加至缓冲液中，得到脂质纳米颗粒溶液；
5.一种阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，其特征在于，包括组分：脂质纳米颗粒、阴离子聚合物以及核酸类药物。
6.根据权利要求5所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统，其特征在于，包括以下条件中的一项或多项：
7.如权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统的制备方法，包括步骤：将阴离子聚合物和核酸类药物溶液充分混合均匀，加入脂质纳米颗粒溶液混合均匀，室温静置，得到阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统；
8.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒在具有预防性或治疗性的核酸递送载体中的应用。
9.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒或权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在预防或治疗疾病药物中的应用。
10.如权利要求1-3任意一项所述脂质纳米颗粒或权利要求5-6任意一项所述阴离子聚合物协同脂质纳米颗粒核酸递送系统在对象中诱导蛋白质表达的药物中的应用；优选的，所述对象是哺乳动物。
