本发明涉及蛋白检测，尤其涉及一种无标签lc-ms联合rppa的深层蛋白质组学分析方法及应用。
背景技术：
1、现如今，定量蛋白质组学，特别是高通量蛋白质组学技术已经成为在许多疾病环境中发现新型蛋白质生物标志物的前沿分析方法。蛋白质组学(proteomics)以肿瘤蛋白质组为研究对象，从整体的角度分析肿瘤细胞内动态变化的蛋白质组成与变化规律。蛋白质组学方法也是肿瘤疗效预测研究的重要方法之一，人们期望临床蛋白质组学研究将为开发更好的诊断和预后工具、确定新的治疗靶点并最终实现患者个性化治疗做出重大贡献。
2、高通量蛋白质组学技术已经成为在许多疾病环境中发现新型蛋白质生物标志物的前沿分析方法。但是，对于常用的蛋白检测技术，如elisa和westernblot来说，不能实现对于高通量蛋白标志物的检测，也无法从高通量数据中挖掘获取更多关于机制、通路等生物信息学的信息。
3、并且，传统检测仅使用一种检测平台，例如液相串联质谱检测(一种用于肺癌检测的生物标志物及其系统cn115575636b)、酶联免疫检测elisa(一种诊断待测者是否是乳腺癌的系统以及生物标志物cn115798712b)等来对癌症中的蛋白生物标志物进行筛查或检测。要想对蛋白质组学数据获得更深入更全面地了解，单项技术本身存在其局限性，不能明确该技术是否具有数据分析结果的不可替代性和全面性。
4、此外，传统检测是一种技术对应一份检测样本，同一份样本很难同时用于多种检测技术，这对于很多珍贵样本来说是一种资源浪费。因此，样本的多样化也增加了检测的难度和限制，在一定程度上造成了样本资源的浪费。如果可以使用一份样本同时进行两种技术的联合蛋白组学检测，可以优化样本处理流程，有效提高样本的利用率，合理规避样本稀缺造成的检测障碍。
5、基于质谱(ms)的检测方法由于其分析速度快，灵敏度高，已成为生物样品中蛋白质定性和定量检测的关键策略选择。首先，串联质谱(ms/ms)具有非常高的灵敏度，因为它能够积累和捕获前体离子，而且串联质谱通常比ms扫描受到更少的化学噪声的影响，对于多肽的检测串联质谱比起质谱更容易。其次，由于蛋白质组学分析固有的复杂性(即大量肽离子和电荷态)，串联质谱可以获得更高检测特异性。此外，多个碎片离子的存在对定量分析有潜在的好处，可以获得更精确的检测结果(lc-mass)。目前，蛋白质鉴定广泛采用高效液相色谱(hplc)-电喷雾电离(esi)-串联质谱(ms/ms)技术进行多肽分离，定量方法可分为基于标记的方法和无标记的方法。无标记的方法由于成本低，随着质谱分辨率的提高已经得到广泛应用。然而质谱技术受到物质质量精度的影响，质量精度降低会导致假阳性的出现，并且由于伪等压肽(pseudo-isobaricpeptides)的离子碎片导致的卷积谱容易使质谱精度受到影响。
6、反相蛋白微阵列(reverse phase proteinarray,rppa)技术是一种结合平面高精度大规模样品蛋白抗原微阵列打印和抗体检测的高通量蛋白组学技术，rppa技术平台设计严谨精密，流程高度自动化，质量控制极其严格。rppa可在15毫克组织中(米粒大小)一次性分析多达500种以上不同丰度蛋白，具有其它高通量蛋白组学所无可比拟的超高特异性和灵敏度，可以对大量细胞表面受体蛋白、细胞信号关键蛋白及蛋白修饰(磷酸化、乙酰化、甲基化等)、蛋白酶类、转录因子等各类代表性靶标进行分门别类的系统深度检测，也可根据需求定制所需研究的靶点蛋白进行分析，包括直接和间接的上下游蛋白网络分析。rppa可应用于蛋白功能与调控机理分析、细胞信号转导全景扫描、肿瘤标志物及蛋白分子分型、药物靶标发现与药物机理分析等不同领域。
7、虽然基于质谱发现蛋白质组学在生物标志物分析中具有重要的前景，但是并未发现有论著或发明报道过有关质谱和rppa技术联用或者技术比较的相关研究。在癌症生物学领域，反相蛋白微阵列(rppa)已被列为癌症相关生物标志物分析的优秀实验方法。rppa最初设计用于解决癌症中信号通路的改变，适合于高通量的靶向蛋白质组学。由于高度敏感的基于抗体的检测和扩增方法，rppa专注于关键信号通路中的蛋白质，转录调控及其修饰的蛋白形式，这些蛋白是低蛋白表达体，但在癌变过程中药效学和药物靶标中具有重要的功能决定因素。因此，除了质谱传统检测方法，在癌症的蛋白组学的生物标志物的检测中，rppa技术是有必要纳入联合使用的，它可以作为质谱检测的一项互补技术，从另一个技术维度探究对于蛋白组学、机制通路的影响作用，有效的增加蛋白质靶点的覆盖范围。对于数据分析层面来说，使用单一蛋白组学检测方法并不能通过go和kegg分析阐述全面完整的生物学机制。
8、在2018年，gromov等人在molecular oncology杂志发表了一篇文章(a singlelysis solution for the analysis oftissue samples by different proteomictechnologies)，介绍了一种用于不同蛋白质组学技术(包括串联质谱和rppa)的组织样品分析的单一裂解溶液。然而，这项工作使用差异凝胶电泳(dige)对蛋白质进行分离，使用基质吸收激光解离将蛋白质碎片化处理从而进行质谱分析，而非基于液相色谱串联质谱分析(lc-ms)。此外，两种裂解液的配方和处理方法也有所差异。
9、专利cn 109725072a介绍了一种基于lc-ms/ms技术的筛查癌症生物标志物的靶向定性定量代谢组学分析方法，该发明只使用一种技术，即lc-ms/ms技术作为分析方法，并对血浆中癌症相关的核心代谢物进行了定量分析，并通过kegg分析出了可能存在的次级代谢产物。
10、因此，本发明提出了一种利用无标签质谱(label-free ms)和反相蛋白阵列(rppa)这两种常用的高通量蛋白质组学技术建立一个联合工作流程，旨在增强基于组织的蛋白质组学发现的蛋白质靶点的覆盖范围。既提高了样本的利用率，又可以使两种技术相辅相乘，对蛋白组学的数据进行更全面和具体的分析和研究，同时也为tnbc肿瘤在发生发展过程中机制通路信息提供了更全面的证据链。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种无标签lc-ms联合rppa的深层蛋白质组学分析方法及应用。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种无标签lc-ms联合rppa的深层蛋白质组学分析方法，包括如下步骤：
4、将待测组织置于裂解缓冲液中充分研磨裂解，蛋白定量，然后分别进行lc-ms/ms分析和rppa检测流程，最后将检测的数据进行生信分析。
5、进一步的，所述裂解缓冲液的组成为：1-100mm ph 7.4的hepes、10-800mm nacl、0.1-10mm egta、1-100mm焦磷酸钠、10-1000mm氟化钠、0.1-10mm mgcl2、0.1-10％tritonx-100、1-50％甘油、0.1-10mm原氰酸钠、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂均按照50ml/template的添加浓度进行检测。
6、进一步的，所述待测组织与裂解缓冲液的质量体积比为1:5-1:50，所述研磨裂解的参数为：1-4个周期，每个周期15-60秒，冷却时间间隔5-30秒，匀浆后的样品在0-20℃、10000-18000rpm下离心10-20min。
7、进一步的，所述蛋白定量至蛋白质的浓度高于1mg/ml。
8、进一步的，所述lc-ms/ms分析的流动相为：a溶液0.1％甲酸水和b溶液0.1％的80％乙腈，流动相的流速为300nl/min；所述lc-ms/ms分析的数据的数据处理方法为：采用proteome discoverer2.4软件对dda法采集的原始文件进行分析；采用dia法收集的原始文件，使用spectronautv17软件与human fasta文件进行分析。
9、进一步的，所述rppa检测的数据处理方法为：使用microvigene软件5.6.0.8，对图像进行数字化变换；输出文本和图像文件使用r包supercurve进行supercurve拟合。
10、进一步的，所述生信分析为：质谱和rppa分析生成的所有数据均在rversion-4.1.0中处理；所有数据清洗、聚类、差异表达分析、相关性分析、重叠分析主要使用r包：dplyr、ggplot2、pheatmap、clusterprofiler、limma、veendiagram进行绘制；相关性分析采用对数变换后的质谱数据进行绘制，rppa采用归一化的normlog2数据进行绘制；对于单个rppa靶点的差异表达，采用willcox秩和检验。
11、本发明还提供了一种上述分析方法在癌症检测方面的应用。
12、本发明提供的无标签lc-ms工作流程，对lc-ms试剂和复杂的ms运行设置没有特殊要求，并与rppa蛋白质组学技术并行结合，试图在组织和细胞系设置中建立一个精简的从样品制备到数据采集的工作流程，扩大了基于组织的蛋白质组学发现的蛋白质靶点的覆盖范围。使用一体化检测流程，提高了样本的利用率，优化了稀有样本使用资源，而且这两种技术相辅相乘，对蛋白组学的数据进行更全面和具体的分析和研究，同时也为tnbc肿瘤在发生发展过程中机制通路提供了更全面的证据链。
13、本发明通过火山图、热图、点图、韦恩图、go图、kegg图等生物信息学分析流程详细的阐明了在质谱和rppa两种技术中存在的差异表达蛋白以及下游通路激活模式，并说明质谱数据侧重于分析肿瘤发生发展过程中rna剪接、翻译调控、代谢过程，而rppa更侧重于翻译后修饰、细胞功能如增殖、粘附和凋亡的过程。通过kegg通路分析还揭示了它们的个体调控模式的差异，质谱强调神经变性调控、氧化过程和rna/蛋白质合成调控，rppa在多种癌症和关键的致癌信号通路如egfr、her2、mtor、foxo、hif-1、pd-1/dp-l1的动态调控。
14、此外，本发明还在细胞层面进行了技术稳定性的验证。对于rppa而言，由于其更侧重于细胞内的信号传导，所以顶部的大多数差异表达蛋白富集于细胞生长调节、丝氨酸/苏氨酸磷酸化、tor信号传导等细胞分化和发育过程中。总的来说，这些数据进一步支持了我们的方法在不同状态的体外细胞分析中的总体可行性，并阐明了两种蛋白质组学技术在分析生物样品方面的技术稳健性和互补性。
1.一种无标签lc-ms联合rppa的深层蛋白质组学分析方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述分析方法，其特征在于，所述裂解缓冲液的组成为：1-100mm ph7.4的hepes、10-800mm nacl、0.1-10mm egta、1-100mm焦磷酸钠、10-1000mm氟化钠、0.1-10mm mgcl2、0.1-10％triton x-100、1-50％甘油、0.1-10mm原氰酸钠、蛋白酶抑制剂、磷酸酶抑制剂，蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂均按照50ml/template的添加浓度进行检测。
3.根据权利要求2所述分析方法，其特征在于，所述蛋白酶抑制剂为roche05056489001，所述磷酸酶抑制剂为roche 04906837001。
4.根据权利要求3所述分析方法，其特征在于，所述待测组织与裂解缓冲液的质量体积比为1:5-1:50，所述研磨裂解的参数为：1-4个周期，每个周期15-60秒，冷却时间间隔5-30秒，匀浆后的样品在0-20℃、10000-18000rpm下离心10-20min。
5.根据权利要求4所述分析方法，其征在于，所述蛋白定量至蛋白质的浓度高于1mg/ml。
6.根据权利要求5所述分析方法，其特征在于，所述lc-ms/ms分析的流动相为：a溶液0.1％甲酸水和b溶液0.1％的80％乙腈，流动相的流速为300nl/min；所述lc-ms/ms分析的数据的数据处理方法为：采用proteome discoverer 2.4软件对dda法采集的原始文件进行分析；采用dia法收集的原始文件，使用spectronautv17软件与human fasta文件进行分析。
7.根据权利要求6所述分析方法，其特征在于，所述rppa检测的数据处理方法为：用microvigene软件5.6.0.8版本，对图像进行数字化变换；输出文本和图像文件使用r包supercurve进行supercurve拟合。
8.根据权利要求7所述分析方法，其特征在于，所述生信分析为：质谱和rppa分析生成的所有数据均在rversion-4.1.0中处理；所有数据清洗、聚类、差异表达分析、相关性分析、重叠分析主要使用r包：dplyr、ggplot2、pheatmap、clusterprofiler、limma、veendiagram进行绘制；相关性分析采用对数变换后的质谱数据进行绘制，rppa采用归一化的normlog2数据进行绘制；对于单个rppa靶点的差异表达，采用willcox秩和检验。
9.一种权利要求1～8任一项所述分析方法在癌症检测方面的应用。
