本发明涉及干细胞修复，特别涉及一种宫内膜干细胞在阴道结缔组织弹性黏膜修复中的应用。
背景技术：
1、子宫是女性极其重要的生殖器官，同时，在受精卵着床、胚胎发育以及胎儿分娩过程中，子宫具有不可替代的作用。然而，子宫的这些重要功能主要通过子宫内膜得以实现。
2、子宫内膜是由胚胎发育过程中的中胚层组织(包括中肾管组织和苗勒管)完全融合而成，位于子宫腔与子宫肌层之间，是人体新陈代谢和自我更新最为活跃的组织之一。子宫内膜分为功能层和基底层2层。功能层，由基底层再生而来，受卵巢性激素的影响发生周期性变化；基底层靠近子宫肌层，不受卵巢性激素周期性变化的影响。研究表明，在女性的育龄期，子宫内膜需经历400多次的再生、分化和剥脱的循环过程。正常的月经周期中，当功能层剥脱后，基底层即开始增生，促进其修复和再生。因此，基底层一旦受到损伤，会影响功能层对性激素的应答，导致子宫内膜的再生能力下降。
3、女性阴道上皮柔软易弯曲，得益于雌激素、乳酸杆菌、阴道ph等维持精密的平衡机制。其可以保持正常水平的水合作用和润滑度。在进行清宫术、诊断性刮宫、子宫内膜消融术、子宫整形术等各种宫腔操作中，如果损伤子宫内膜基底层可导致子宫内膜修复障碍，是薄型子宫内膜形成的重要原因。其中较常见的情况是人工流产后宫腔粘连，即asherman综合征。子宫内膜长期暴露于孕激素的作用下，可能导致孕激素拮抗雌激素对子宫内膜的增生作用，从而最终引起子宫内膜萎缩，引起细胞微环境改变，不利于子宫内膜的修复。
4、子宫内膜干细胞是作为修复子宫内膜的一种新型治疗方向，经血中包含的子宫内膜脱落细胞可在体外分离并培养出子宫内膜间充质干细胞，具有复制快、来源广、取材易、含量多、无创获得等优点，其大量制备子宫内膜干细胞提供支持。然而，现有的子宫内膜干细胞制剂无法兼具抑菌和修复功能，往往是需要与抑菌药物组合使用，势必会引起耐药性，且对子宫内膜产生持续再生的作用有限。
技术实现思路
1、针对现有技术所存在的技术问题，本发明提供了一种宫内膜干细胞在阴道结缔组织弹性黏膜修复中的应用。首次利用修复肽基因改造宫内膜干细胞，提高其阴道结缔组织弹性黏膜修复功能，同时，该修复肽也具备良好的抑菌活性。经改造后的宫内膜干细胞能够有效抑制阴道细菌的生长，改善阴道健康状况，同时兼具结缔组织弹性黏膜修复功能，能有效修复子宫内膜，恢复其正常厚度，有效提高了生育能力。
2、本发明的首要目的是提供了一种宫内膜干细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
3、1)宫内膜干细胞的分离；
4、2)宫内膜干细胞的培养；
5、5)宫内膜干细胞的鉴定；
6、6)利用修复肽改造宫内膜干细胞；
7、优选地，步骤1)包括：
8、取子宫内膜组织，剔除脂肪、系膜，并用1×pbs(ph＝7.0)进行冲洗，并用手术剪将子宫内膜组织剪碎；采用0.25％胰蛋白酶，37℃震荡酶解消化子宫内膜组织碎片40-60min；并向消化液中加入等体积含10％fbs的dmem完全培养基终止消化；收集消化液，1000rpm离心10-20min，弃掉上清液，将离心后所得沉淀加入dmem完全培养基吹打均匀后，接种于25ml培养瓶中，在37℃、5％co2培养箱内培养，每隔2天更换新鲜培养液。
9、优选地，步骤2)包括：待步骤1)中的细胞长至约80％融合时进行传代；在超净工作台内弃掉培养瓶中旧培养液，用1×pbs(ph＝7.0)冲洗培养瓶3遍，并着重冲洗培养瓶底部后，加入胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)10ml，于培养箱内消化5min，取出后于倒置显微镜下观察，若贴壁细胞数量较多，轻轻晃荡培养瓶，当大部分细胞漂浮时，加入等体积的dmem完全培养基终止消化；最后，1000rpm离心10-20min，并将细胞以1:2进行传代，标记为p1；此后，每隔2天更换新鲜培养液，重复上述步骤进行p2、p3代稳定细胞。
10、优选地，步骤3)包括：取生长状态良好的p3细胞，胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)消化细胞，加入dmem培养基，重悬，制成1.0×106/ml的细胞悬液，利用流式细胞仪检测cd29，cd44，cd73，cd90，cd105，cd146、cd45、cd34和cd117标记；结果显示：p3代细胞高表达cd29，cd44，cd73，cd90，cd105，cd146(＞95.3％)，低表达cd34，cd45、cd117(<5.7％)。
11、优选地，步骤4)包括：将修复肽seq id no.1的编码序列seq id no.2与pegfp-n1载体连接，通过电穿孔方式导入步骤3)宫内膜干细胞进行稳定表达。
12、本发明的另一目的在于提供了一种宫内膜干细胞水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
13、1)将10-40mg海藻酸钠和1.0×106-109cells实施例1得到的宫内膜干细胞溶解于50-100ml生理盐水；
14、2)向步骤1)中缓慢滴加5-10mm cacl2水溶液，滴加过程同时进行涡旋混匀处理，至溶液透亮发白为止，静置5-10min即可得到宫内膜干细胞水凝胶。
15、进一步优先地，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
16、1)将10mg海藻酸钠和1.0×106cells实施例1得到的宫内膜干细胞溶解于50ml生理盐水；
17、1)向步骤1)中缓慢滴加5mm cacl2水溶液，滴加过程同时进行涡旋混匀处理，至溶液透亮发白为止，静置5min即可得到宫内膜干细胞水凝胶。
18、进一步优先地，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
19、1)将30mg海藻酸钠和1.0×108cells实施例1得到的宫内膜干细胞溶解于70ml生理盐水；
20、2)向步骤1)中缓慢滴加8mm cacl2水溶液，滴加过程同时进行涡旋混匀处理，至溶液透亮发白为止，静置8min即可得到宫内膜干细胞水凝胶。
21、进一步优先地，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
22、1)将50mg海藻酸钠和1.0×109cells实施例1得到的宫内膜干细胞溶解于100ml生理盐水；
23、2)向步骤1)中缓慢滴加10mm cacl2水溶液，滴加过程同时进行涡旋混匀处理，至溶液透亮发白为止，静置10min即可得到宫内膜干细胞水凝胶。
24、进一步地，本发明还提供了一种宫内膜干细胞水凝胶在制备阴道结缔组织弹性黏膜修复药物中的用途。
25、本发明的优点如下：本发明首次提供了利用修复肽基因改造宫内膜干细胞，提高其阴道结缔组织弹性黏膜修复功能，同时，该修复肽也具备良好的抑菌活性。经改造后的宫内膜干细胞能够有效抑制阴道细菌的生长，改善阴道健康状况，同时兼具结缔组织弹性黏膜修复功能，能有效修复子宫内膜，恢复其正常厚度，有效提高了生育能力。
1.一种宫内膜干细胞制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤1)包括：
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤2)包括：待步骤1)中的细胞长至80％融合时进行传代；在超净工作台内弃掉培养瓶中旧培养液，用1×pbs(ph＝7.0)冲洗培养瓶3遍，并着重冲洗培养瓶底部后，加入胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)10ml，于培养箱内消化5min，取出后于倒置显微镜下观察，若贴壁细胞数量较多，晃荡培养瓶，当大部分细胞漂浮时，加入等体积的dmem完全培养基终止消化；最后，1000rpm离心10-20min，并将细胞以1:2进行传代，标记为p1；此后，每隔2天更换新鲜培养液，重复上述步骤进行p2、p3代稳定细胞。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤3)包括：取生长状态良好的p3细胞，胰蛋白酶-edta消化液(0.25％)消化细胞，加入dmem培养基，重悬，制成1.0×106/ml的细胞悬液，利用流式细胞仪检测cd29，cd44，cd73，cd90，cd105，cd146、cd45、cd34和cd117标记；结果显示：p3代细胞高表达cd29，cd44，cd73，cd90，cd105，cd146(＞95.3％)，低表达cd34，cd45、cd117(<5.7％)。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤4)包括：将修复肽seq id no.1的编码序列seq id no.2与pegfp-n1载体连接，通过电穿孔方式导入步骤3)宫内膜干细胞进行稳定表达。
6.一种宫内膜干细胞水凝胶的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
9.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述宫内膜干细胞水凝胶的制备方法包括如下步骤：
10.一种如权利要求6-9任一项所述方法制备得到的宫内膜干细胞水凝胶在制备阴道结缔组织弹性黏膜修复药物中的用途。
