本发明属于基因工程领域，特别涉及一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法。
背景技术：
1、公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
2、吩嗪-1-羧酸是一种生物活性物质，因为其对农作物病害的良好防治效果，2011年被中华人民共和国农业部授予农药证书，并正式命名为“申嗪霉素”，吩嗪-1-羧酸的生产可以用化学合成法之外的生物合成来进行，例如：以铜绿假单胞菌发酵生产，但铜绿假单胞菌是条件致病菌，因此，应用相对比较安全的绿针假单胞菌qlu-1作为生产菌株，但目前生产菌株存在吩嗪-1-羧酸产量低的问题，产量只有270mg/l左右，达不到应用的水平，提高工程菌的产量成为迫切需求。
3、前期发明人通过基因工程操作将菌株的吩嗪-1-羧酸产量提升到了4780 mg/l。但吩嗪-1-羧酸的生产成本仍然很高，仍需要提高工程菌株的产量，来降低吩嗪-1-羧酸的成本，为吩嗪-1-羧酸的推广应用做准备。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法，通过将 aroc基因、 phzir基因整合进基因组，增强吩嗪合成前导途径-莽草酸途径及吩嗪合成途径，使初始菌株的吩嗪-1-羧酸的产量由4787.2mg/l提升到7746mg/l。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、本发明的第一个方面，提供了一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，以绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth为出发菌株，在所述绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth中 hppa基因被敲除的位点引入 aroc基因，获得菌株qpca△dth:c；
4、和/或，将 phzir基因导入所述菌株qpca△dth:c的 detg基因位点，得到qpca△dth:c:ir基因工程菌。
5、在一些实施方式中，所述 aroc基因的碱基序列如seq id no.1所示。
6、在一些实施方式中，所述 phzir基因的碱基序列如seq id no.9所示。
7、在一些实施方式中，所述绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth是敲除绿针假单胞菌( pseudomonas chlororaphis) qlu-1基因组中的 phzo基因、 degu基因、 tctb基因和 hppa基因而得，其中，绿针假单胞菌qlu-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctccno：m2020108，已于专利zl202210712676.8中公开。
8、在一些实施方式中，所述引入 aroc基因的具体步骤包括：
9、在已经测序的qlu-1基因组序列中搜索 aroc基因序列及 hppa基因的上下游序列，并通过pcr分别钓取 aroc基因、 hppa基因上游片段hppa-u、 hppa基因下游片段hppa-d，通过融合pcr将三个片段连在一起，获得aroc-hppa-ud融合片段；
10、将所述aroc-hppa-ud融合片段连接质粒pk18mobsacb构建 aroc基因组重组质粒pk18-aroc-hppa-ud；
11、将所述 aroc基因组整合质粒pk18-aroc-hppa-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir）；
12、再与所述绿针假单胞菌qpca△dth进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得突变菌株qpca△dth:c。
13、在一些实施方式中，aroc-hppa-ud融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
14、在一些实施方式中，所述 aroc基因导入基因组引物包括：aroc-f1、aroc -r1、aroc-f2、aroc -r2、aroc-f3、aroc -r3，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq id no.7、seq id no.8所示。
15、在一些实施方式中，所述导入 phzir基因的具体步骤包括：
16、在已经测序的qlu-1基因组序列中搜索 phzir基因序列及 detg基因的上下游序列，并通过pcr分别钓取 phzir基因、 detg基因上游片段detg-u、 detg基因下游片段detg-d，通过融合pcr将三个片段连在一起，获得phzir-detg-ud融合片段；
17、将所述phzir-detg-ud融合片段连接质粒pk18mobsacb构建 phzir基因组重组质粒pk18-phzir-detg-ud；
18、将所述 phzir基因组整合质粒pk18-phzir-detg-ud导入大肠杆菌s17-1（λpir）；
19、再与所述突变菌株qpca△dth:c进行双亲杂交培养，筛选阳性克隆，即得突变菌株qpca△dth:c:ir。
20、在一些实施方式中，phzir-detg-ud融合片段的碱基序列如seq id no.10所示；
21、在一些实施方式中，所述 phzir基因导入基因组引物包括：phzir -f1、phzir -r1、phzir -f2、phzir -r2、phzir -f3、phzir-r3，序列分别如seq id no.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14、seq id no.15、seq id no.16所示。
22、本发明的第二个方面，提供了一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法，包括：
23、构建上述的基因工程菌qpca△dth:c:ir；
24、使用所述基因工程菌qpca△dth:c:ir发酵生产吩嗪-1-羧酸，即得。
25、在一些实施方式中，所述发酵培养基可以是kb培养基。
26、本发明的有益效果
27、(1) 本发明以专利zl202210712676.8中来源于绿针假单胞菌qlu-1的工程菌qpca△dth为出发菌株，通过整合吩嗪合成的前导途径-莽草酸途径中关键酶基因 aroc进基因组，促使莽草酸途径的产物分支酸更多的合成， aroc基因的整合位点，本发明选择菌株qpca△dth中被敲除的 hppa基因位点，加强吩嗪合成的前导途径，获得突变菌株qpca△dth:c，经发酵后，吩嗪-1-羧酸产量显著提升，提高到5696mg/l。
28、吩嗪的合成除了 phzabcdef基因参与外， phzir基因通过产生信号分子也参与吩嗪的合成，本发明这里通过将 phziphzr基因(两个基因在绿针假单胞菌中相邻)导入△dth: c的 detg基因位点，促进菌株的吩嗪合成途径，从而增强吩嗪的合成，本发明获得突变菌株qpca△dth:c:ir，经发酵后，菌株的吩嗪-1-羧酸产量提升到7746mg/l。
29、(2)本发明利用kb培养基发酵，产量达到7746mg/l，大大提高了菌株的产能，为后续工程菌株的工业化提供了坚实基础。
1.一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，以绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth为出发菌株，在所述绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth中hppa基因被敲除的位点引入aroc基因，获得菌株qpca△dth:c；
2.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述aroc基因的碱基序列如seq id no.1所示。
3.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述phzir基因的碱基序列如seq id no.9所示。
4.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述绿针假单胞菌基因工程菌qpcaδdth是敲除绿针假单胞菌(pseudomonas chlororaphis) qlu-1基因组中的phzo基因、degu基因、tctb基因和hppa基因而得，其中，绿针假单胞菌qlu-1已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为cctcc no：m2020108。
5.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述引入aroc基因的具体步骤包括：
6.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，aroc-hppa-ud融合片段的碱基序列如seq id no.2所示。
7.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述aroc基因导入基因组引物包括：aroc-f1、aroc -r1、aroc -f2、aroc -r2、aroc-f3、aroc -r3，序列分别如seq id no.3、seq id no.4、seq id no.5、seq id no.6、seq idno.7、seq id no.8所示。
8.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，所述导入phzir基因的具体步骤包括：
9.如权利要求1所述的利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的基因工程菌，其特征在于，phzir-detg-ud融合片段的碱基序列如seq id no.10所示；
10.一种利用增强合成途径促进吩嗪-1-羧酸生产的方法，其特征在于，包括：
