本发明属于医药，具体涉及一种通过人工嵌合受体实现靶向性的低免疫原性囊泡药物递送系统的制备方法和应用。
背景技术：
1、恶性肿瘤严重威胁人类健康。根据世界卫生组织(who)的数据，全球每年新发生的恶性肿瘤病例超过1,930万例。这表明恶性肿瘤在全球范围内具有广泛的流行病学分布。同时，恶性肿瘤也是全球范围内的主要死因之一。据who的报告，2018年全球有约970万人死于恶性肿瘤，约占所有死亡原因的13％。此外，根据国际癌症研究机构(iarc)的数据，恶性肿瘤是全球负担最重的疾病之一，每年因恶性肿瘤导致的疾病负担约为1960万伤残调整生命年(dalys)。
2、化疗是恶性肿瘤的一种主要治疗手段之一。化疗药物可以通过杀死癌细胞或抑制其生长来减少或消除肿瘤。近年来针对特定的分子靶点研发的靶向药物也被纳入化疗方案，通过针对特定的分子靶点来杀死肿瘤细胞或抑制其生长。化疗还可以通过输送药物到全身循环系统中，控制肿瘤在整个身体中的扩散。尽管如此，大多数化疗药物在杀伤肿瘤细胞的同时，也会对机体正常细胞和器官造成损害，引发骨髓抑制、胃肠道反应、皮炎、肝肾毒性作用等不良反应。因此，通过特定的靶向机制将药物精确地送达到肿瘤部位，最大限度地减少对正常组织的影响，可以有效提高恶性肿瘤患者的治疗效果和生活质量。
3、近年来，外泌体(exosome)作为一种新兴的细胞外囊泡引起了广泛关注。外泌体是由细胞分泌出来的小型囊泡，内含有多种生物活性分子，如蛋白质、核酸和脂质等。它们被广泛认为是细胞间通讯的重要媒介，可以通过传递其内部的生物分子，影响靶细胞的功能和行为。通过基因工程编辑的工程化外泌体作为一种新兴的纳米载体，近年来成为肿瘤治疗领域的研究热点。工程化外泌体是通过改造和修饰自然的外泌体，提高其在肿瘤治疗中的应用潜力。它们可以携带药物、基因和其他生物活性分子，并通过靶向修饰将其精确地传递到肿瘤细胞中，实现个体化治疗和提高治疗效果。
技术实现思路
1、为了实现上述目标，本发明提出了一种通过人工嵌合受体实现靶向性的低免疫原性囊泡药物递送系统及其制备方法，以及其在肿瘤治疗中的应用。
2、本发明提供一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，该囊泡递送系统具有特异性结合肿瘤抗原的scfv结构域，能够在外泌体中富集的跨膜结构域以及具有示踪功能的囊泡内结构域。这些特性使得囊泡能够精确地识别和结合恶性肿瘤细胞，实现药物的特异性递送。
3、本发明的第一方面，提供一种外泌体示踪系统，由外泌体膜富集蛋白与示踪蛋白嵌合构成。所述外泌体膜富集蛋白包括但不限于cd63、cd9、cd81、lamp2b、pdgfr。所述示踪蛋白可以为光激发发光蛋白，包括但不限于蓝色荧光蛋白bfp、绿色荧光蛋白gfp、黄色荧光蛋白yfp、红色荧光蛋白rfp；也可以为生物发光蛋白，包括但不限于萤火虫荧光素酶(firefly luciferase)海参荧光素酶(renilla luciferase)、腔肠素蛋白；化学显色反应催化蛋白，包括但不限于分泌型碱性磷酸酶、过氧化物辣根酶。
4、外泌体示踪系统可以由上述任意一外泌体膜富集蛋白与一个或多个示踪蛋白构成，由其氨基酸序列为seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seq idno.9所示，其dna序列为seq id no.2、seq id no.4、seq id no.6、seq id no.8、seq idno.10所示。
5、优选的，在本发明的一项应用实例中，使用seq id no.7/8(氨基酸/dna)作为外泌体示踪系统。
6、本发明的第二方面，提供了一种降低外泌体同种异体免疫反应的方法，通过敲除种子细胞中的β2m基因使mhc-i表达缺失，和/或敲除种子细胞中的ciita基因使mhc-ii表达缺失，从而产生低免疫原性的外泌体。所述种子细胞包括不限于hek-293及其衍生细胞系(hek-293t、hek-293f、hek-293a等)、人间充质干细胞、人永生化皮肤细胞hacat、人永生化脐静脉内皮细胞huevc、人胚胎干细胞h9、人永生化宫颈上皮细胞h8、人自然杀伤细胞系nk92。基因敲除可使用cas9与sgrna共表达质粒转染种子细胞，或使用cas9蛋白与人工合成的sgrna共转染种子细胞。其中β2m的sgrna为seq idno.11、seq id no.12、seq id no.13、seq id no.14的任意一条；ciita的sgrna为seq id no.15、seq id no.16、seq id no.17、seq id no.18。
7、优选的，在本发明的一项应用实例中以hek-293f为种子细胞，使用seq id no.13作为sgrna敲除β2m构建了低免疫原性的外泌体种子细胞。
8、本发明的第三方面，提供了一种精准靶向膜抗原、同时可以体内示踪的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，为实现这一目的，嵌合受体由外泌体富集蛋白信号肽、抗原结合结构域、外泌体富集蛋白跨膜区、胞内段示踪蛋白构成。
9、所述信号肽为选自下组外泌体富集蛋白的信号肽：cd63信号肽，其氨基酸序列为seq id no.19所示，dna序列为seq id no.20所示；cd81信号肽，其氨基酸序列为seq idno.21所示，dna序列为seq id no.22所示；pdgfr信号肽，其氨基酸序列为seq id no.23所示，dna序列为seq id no.24所示；lactadherin信号肽，其氨基酸序列为seq id no.25所示，dna序列为seq idno.26所示。
10、所述抗原结合结构域为可特异性结合肿瘤细胞抗原的单链抗体结构域(scfv)，其构造可以为vh-linker-vl或vl-linker-vh两种构型之一。链接子(linker)的氨基酸序列本领域已知且经过验证的，包括但不限于seq idno.27、28、29、30、31、32所示氨基酸序列。可用于外泌体靶向的靶点包括但不限于cd19、gpc3、bcma、cd22、cd20、her2、cd30、egfrviii、psma、gd2、cd33、cd123、nkg2dl、mesothelin、muc1、muc6、claudin18.2。靶向外泌体可以表达上述靶点中的一个或多个scfv。
11、所述外泌体富集蛋白跨膜区选自下组外泌体富集蛋白：lamp2b跨膜区，其氨基酸序列为seq id no.33所示，dna序列为seq id no.34所示；pdgfr跨膜区，其氨基酸序列为seq id no.35所示，dna序列为seq id no.36所示。
12、所述胞内段示踪蛋白，其氨基酸序列为seq id no.1、seq id no.3、seq idno.5、seq id no.7、seq id no.9所示，其dna序列为seq id no.2、seq idno.4、seq id no.6、seqid no.8、seq id no.10所示。
13、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向gpc3的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.37所示，dna序列为seq id no.38所示。
14、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向mesothelin的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.39所示，dna序列为seq id no.40所示。
15、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向claudin18.2的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.41所示，dna序列为seq id no.42所示。
16、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向cd19的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.43所示，dna序列为seq id no.44所示。
17、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向muc1 n端结构域的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.45、seq idno.47、seq id no.49、seq id no.51所示，dna序列为seq id no.46、seq id no.48、seq id no.50、seq id no.52所示。
18、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人提供了一种靶向muc1 c端结构域的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列为seq id no.53、seq idno.55、seq id no.57所示，dna序列为seq id no.54、seq id no.56、seq id no.58所示。
19、优选的，在本发明的一项应用实例中，采用了seq id no..45-58(氨基酸/dna)序列转染hek293f细胞衍生了靶向muc1的工程化外泌体，并对其进行了表征。
20、本发明的第四方面，提供了利用上述嵌合蛋白规模化生产靶向外泌体并将其用于载药治疗恶性肿瘤的方案，如图14所示，包括如下步骤：
21、a、基因元件的设计与合成
22、根据特定靶点设计其靶向的嵌合受体结构：嵌合受体可以靶向单靶点，也可通过串联抗原识别结构域实现靶向多靶点。设计好的dna序列通过固相合成获得完整序列。
23、优选的，在本发明的一项应用实例中，申请人使用seq id no..53/54(氨基酸/dna)合成了嵌合受体结构，用与产生靶向外泌体。
24、b、慢病毒载体构建与工程化种子细胞的构建
25、将表达嵌合受体的基因片段克隆至慢病毒基因载体质粒，可选的质粒包括但不限于plvx、pcdh、plenti、psin、prrl；优选的，在一项应用实例中，申请人使用plvx作为基因载体用于生产慢病毒。在基因载体经过扩增后，以pmd2.g与pcmvr8.74作为包装质粒，共同转染lenti-x-293t细胞，在上清液中收集病毒颗粒。这一过程可培养30小时，45小时或60小时，优选的，在本发明中，在中途培养30小时时收集病毒上清液，保存于4℃，补充新鲜培养基再次培养30小时后，收集病毒上清；将两次病毒上清混合后于4℃、25000rpm离心2小时后获得病毒颗粒沉淀，使用50μl～100μlpbs重悬病毒。
26、c、工程化外泌体的种子细胞建系。
27、复苏低代次hek293f细胞作为备转染细胞；传代至倍增时间＜20小时，细胞活力＞98％。充分混匀后，按照一定moi加入包被好的病毒，可以选择moi＝10、moi＝20、moi＝30、moi＝40以及moi＝50，优选的，在本发明的一个应用实例中，按照moi＝30加入包被好的病毒。侵染12小时后，吸取含有细胞与病毒的全部细胞液转移至含有完全培养基的培养瓶中，培养至第4天，facs检测阳性细胞比例。分选单克隆建系。
28、d、工程化外泌体的收集
29、将稳定表达嵌合受体基因的hek293f细胞扩增至5×105/ml，用pbs洗涤细胞后更换无血清培养基重选细胞至密度为2-3×106/ml。重悬细胞37℃培养1小时后，42℃热激2小时；后恢复37℃培养12-16小时，将细胞培养物转移到离心管中，并使用离心机以2000×g离心10分钟，以去除细胞残骸和碎片。随后，将上清液小心地转移到新的离心管中，避免带入沉淀物。再次以10000×g的速度离心30分钟，以沉淀较小的细胞碎片和大颗粒。为了去除较大的细胞碎片和大颗粒，将过滤后的液体使用0.22μm滤膜过滤。过滤后的液体以25000×g的速度离心2.5h，沉淀外泌体。外泌体沉淀使用20％人血白蛋白复溶后，加入20％体积的dmso，梯度降温至-80℃环境中。
30、e、工程化外泌体载药方案
31、本发明提供了两种外泌体荷载药物的方案，共孵育法与超声法。水溶性药物主要指化疗药物，包括但不限于烷化剂类药物(异环磷酰胺、氮芥、环磷酰胺等)、抗核酸代谢类药物(如吉西他滨、氨甲蝶蛉、氟脲嘧啶等)、微管蛋白抑制剂类药物(长春新碱、长春地辛等)、拓扑异构酶抑制剂类药物(羟基喜树碱、拓扑替康、伊立替康等)
32、优选的，在本发明的一个应用实例中给出了盐酸吉西他滨共孵育法载药的操作方案。将外泌体样品转移至离心管中，向离心管中加入适量的吉西他滨溶液，使最终吉西他滨浓度为0.1-2mg/ml。将离心管置于37℃的恒温摇床中，以20rpm轻柔混匀孵育12小时。使用离心机以25000×g的速度离心2.5小时，沉淀外泌体并吸弃上清，去除外泌体样品中未被吸附的吉西他滨。载药后外泌体沉淀使用20％人血白蛋白复溶。4℃短期保存，或冻干后长期保存。
33、优选的，在本发明的一个应用实例中给出了盐酸吉西他滨超声法载药的操作方案。将外泌体转移至1.5ml离心管中，使其填满管子的大约1/3，加入吉西他滨至离心管中至终浓度达到0.1-2mg/ml。设置超声频率为50khz，功率为30-50w/cm2，离心管放置于冰水浴中至温度平衡，超声10-20秒；超声转移离心管至37℃培养箱中孵育1小时，促进外泌体重构；再次将离心管放置于冰水浴中至温度平衡，以相同条件再次超声，并在37℃中孵育重构外泌体。使用离心机以25000×g的速度离心2.5小时，沉淀外泌体并吸弃上清，去除外泌体样品中未被吸附的吉西他滨。载药后外泌体沉淀使用20％人血白蛋白复溶。4℃短期保存，或冻干后长期保存。
34、本发明的有益效果如下：
35、(1)本发明通过敲除种子细胞中的β2m，和/或敲除种子细胞中的ciita基因，从而产生低免疫原性的外泌体使细胞产生低免疫原性外泌体，可以在反复注射后不引起免疫应答。
36、(2)利用外泌体富集蛋白构建嵌合受体，使外泌体具有靶向性。
37、(3)外泌体递送药物可以实现药物在肿瘤病灶内的富集，发挥更强的抗肿瘤作用，并增强药物转运蛋白基因缺陷肿瘤的药物敏感性。
38、(4)外泌体递送药物具有更低的化疗副作用。
1.一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向膜抗原且同时体内示踪的外泌体膜蛋白嵌合受体，所述的外泌体膜蛋白嵌合受体由外泌体富集蛋白信号肽、抗原结合结构域、外泌体富集蛋白跨膜区、胞内段示踪蛋白构成；
2.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，用于外泌体靶向的靶点选自以下任一或多个：cd19、gpc3、bcma、cd22、cd20、her2、cd30、egfrviii、psma、gd2、cd33、cd123、nkg2dl、mesothelin、muc1、muc6、claudin18.2。
3.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的胞内段示踪蛋白其氨基酸序列如seq id no.1、seq id no.3、seq id no.5、seq id no.7、seqid no.9任一所示。
4.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向gpc3的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，其氨基酸序列如seq id no.37所示。
5.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向mesothelin的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，其氨基酸序列如seq idno.39所示。
6.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向claudin18.2的外泌体膜蛋白嵌合受体结构。其氨基酸序列如seqid no.41所示。
7.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向cd19的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，其氨基酸序列如seq id no.43所示。
8.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向muc1 n端结构域的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，其氨基酸序列如seq id no.45、seq id no.47、seq id no.49、seq id no.51任一所示。
9.根据权利要求1所述的一种低免疫原性靶向囊泡递送系统，其特征在于，所述的囊泡递送系统包含一种靶向muc1 c端结构域的外泌体膜蛋白嵌合受体结构，其氨基酸序列如seq id no.53、seq id no.55、seq id no.57任一所示。
10.一种如权利要求1所述的低免疫原性靶向囊泡递送系统的制备方法，包括如下步骤：
11.一种如权利要求1所述的低免疫原性靶向囊泡递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，低免疫原性靶向囊泡递送系统通过孵育法或超声法载药。
12.根据权利要求11所述的低免疫原性靶向囊泡递送系统在制备抗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所载药物为化疗药物。
