本发明属于植物分子生物学领域，具体涉及番茄slbtb6基因及其在提高植物干旱和高温耐受性中的应用。
背景技术：
1、植物生长过程中需要应对各种不利于生长发育的环境条件，这些环境胁迫包括生物胁迫(如病原体感染和食草动物的啃食)和非生物胁迫(如干旱、高温、冷害、盐害、营养缺乏及土壤中的重金属等)。干旱和温度胁迫是影响植物地理分布，限制农业植物产量，威胁全球粮食安全的主要环境因素。全球气候变化将导致极端天气增加，加剧了这些非生物胁迫的不良影响(fedoroff et al.，2010)。因此，了解干旱和高温胁迫对植物生长发育的影响以及植物响应不良环境的机制，对于提供植物抗非生物胁迫的策略，解决粮食安全问题十分关键。
2、干旱胁迫严重危害植物生长发育，在干旱胁迫下植物的形态结构和生理、生化均会受到影响。干旱胁迫会导致植物细胞增殖及生长降低，细胞发育受损(potopova et al.，2016)；干旱情况下植物发芽率降低、叶面积减少、叶绿素水平降低，气孔关闭等，从而降低光合速率和蒸腾速率；极端缺水的情况下会使花粉活力降低(jin et al.，2014)；干旱胁迫会使膜不稳定性增加，降低植物的水分利用率等(fahad et al.，2017；alghabari et al.，2015)。
3、干旱期间，植物需要通过增加根系的水分吸收、关闭气孔以减少水分流失以及调整植物体内渗透过程从而积极地维持水分平衡(rodrigues et al.，2019)。在干旱缺水时期，根系结构通过形态变化，以增强其吸收水分和养分的能力(alvarez et al.，2016)。例如：根系的分支角度变小，根系生长更长可以有效地从土壤深层吸收水分；较浅的根系结构则更有利于最大限度地从土壤表面获取水分(dinneny，2019)。在土壤中水分分布不均匀的情况下，根尖会朝含水量较高的区域生长，以有利于根系结构进行水分的获取(dietrichet al.，2017)。aba诱导的气孔闭合是干旱胁迫下最初和最快的反应之一，能够在几秒或几分钟内发生(geiger et al.，2011)。气孔闭合是植物防止水分丧失的防御手段，叶片表面的气孔根据周围保卫细胞的膨胀度打开或关闭；然而气孔关闭也会导致蒸腾作用和光合作用速率的降低，这使得叶片提前衰老(wahid et al.，2005)。在干旱胁迫下，观察到许多植物中叶片尺寸的变小，气孔数量减少等(rollins et al.，2013；anjum et al.，2021)。由于干旱胁迫下叶绿体和液泡形状产生变化，还会观察到光合作用和呼吸作用的下降，导致基质片层肿胀，这进一步改变了类囊体的结构组织(siddiqui et al.，2015；ashraf et al.，2013)。此外，干旱胁迫下液泡中的无机离子(如k+和cl-)大量积累，具有渗透调节、细胞渗透压快速恢复和维持细胞膨胀等功能(shabala et al.，2002；scharwies et al.，2019)。k+参与许多胁迫信号通路，并通过增强酶活性、蛋白质合成、光合作用、韧皮部运输、电荷平衡和渗透调节来提高植物的耐受性(shabala，2017；chen et al.，2017)；cl-是一类植物阴离子营养元素，能够特异性地促进更高的渗透压、含水量、相对含水量、膨压和叶片肉质性。氯化物能够降低气孔导度和增加叶肉对co2的扩散从而提高水分利用率(franco-navarro etal.，2019；franco-navarro et al.，2016；maron et al.，2019)。
4、btb(broad complex,tramtrack and bricabrac)结构域最初在果蝇中被报道，是含有约115个氨基酸的高度保守结构域(zollman et al.，1994)。btb结构域也称为poz(poxvirus and zinc finger)结构域，主要存在于锌指蛋白的n端，是进化上保守的蛋白与蛋白相互作用基序(bardwel and treisman，1994)。在结构上，btb结构域核心结构由五个α螺旋组成，其中a1/2和a4/5形成α螺旋发夹，三个β链(b1/b2/b3)形成β折叠；b1/b2/a1/a2/b3区域通过螺旋a3和可变接头区域与a4/a5区域连接(stogios et al.，2005)。除了核心区域外，不同的btb蛋白亚类还含有与蛋白特异性功能有关的氨基(n)末端和羧基(c)末端btb延伸区(chaharbakhshi and jemc，2016)。
5、在含有独特的dna结合锌指蛋白中鉴定出btb结构域，表明btb蛋白可以作为转录调节因子。btb蛋白某些亚家族成员仅含btb结构域，同时btb结构域也与其他结构域结合(如：kctd(potassium channel tetramerization domain-containing)，math(meprin andtraf homology)，ank(ankyrin repeats)，npr1(nonexpressor of pathogenesis-relatedproteins1)，nph3(nonphototropic hypocotyl 3)，taz锌指及c-末端的kelch，skp1和arm(armadillo/beta-catenin-like repeat)结构域等)，赋予btb蛋白多种功能(cheng etal.，2014；stogios et al.，2005)。
6、目前，btb蛋白在植物生长发育及抵抗生物和非生物逆境等方面多有报道。番茄中的研究表明，番茄btb基因的第一个完整cdna序列是从耐旱il和其亲本m82之间的不同表达谱中分离出来的(gong et al.，2010)。根据li的研究鉴定了番茄中38个btb基因，并根据所含结构域分为了btb-skp1、btb-kctd、btb-taz、btb-kelch related、btb-math、btb-npr1、btb-arm、btb-nph3等亚家族(li et al.，2018)。番茄中的slbop(blade on petiole)基因与花序结构形成有关，slbop的crispr/cas9敲除植株会导致开花缺陷，最明显表型变化为的是将花序变为单花(xu et al.，2016)。在玉米中，一个math-btb结构域蛋白mab1被报道与种系和胚胎早期发育有关。mab1蛋白仅在玉米的生殖谱系和受精卵中表达，rnai突变植株在减数分裂过程中表现出染色体分离缺陷和短纺锤体现象，最终导致进一步的生殖系发育停滞。与野生型相比，rnai突变植株约有40％胚珠未发育(juranic et al.，2012)。在拟南芥的btb蛋白家族由80个成员组成，这些蛋白参与了各项信号通路。其中，btb和taz结构域蛋白(bt1-bt5)仅在陆地植物中存在。在拟南芥中，btb-taz亚家族有五个成员，他们在雌雄配子体发育中都起着重要作用，其中atbt2是这一过程的主要基因。btb-taz亚成员之间存在功能冗余；当其他bt成员敲除时，通过补偿表达会改变其余btb-taz家族的rna水平(robert et al.，2009)。在拟南芥中，一个bop1基因控制侧生组织的生长和发育。bop基因是包含ankyrin重复序列和btb/poz结构域的基因家族的成员，在植物侧生器官的近端表达。在拟南芥中，bop1和bop2表现出功能冗余，bop2突变植株没有可观察到的突变表型，bop1突变植株仅表现出非常弱的突变表型；而bop1 bop2双突变体表现出了非常明显的发育缺陷。与野生型相比，bop1 bop2双突变体生长更加迟缓，但最终达到与野生型相同的高度；bop1 bop2双突变体的叶片表现出开裂及异位生长，叶片缺少叶柄的表型。在双突变体中，叶片近端在整个发育时期仍持续生长，因此表现出比野生型更大的叶片尺寸(norberget al.，2005)。
7、在植物抵抗生物胁迫与非生物胁迫的过程中，btb蛋白也发挥着作用。有研究报道拟南芥中的bt4(btb and taz domain protein 4)可以增强对丁香甲单胞菌pst dc3000的抗性，而缺失bt4的突变体也会导致植物对水杨酸诱导的对pst dc4的防御反应减弱。进一步研究发现bt4受到乙烯反应因子erf411的转录激活调节，这一步骤为植物对丁香假单胞菌抗性的关键步骤(zheng et al.，2019)。拟南芥中的btb/poz抗病蛋白nrp1(nonexpresser of pr genes1)与tga2相互作用并抑制tga2的功能，最终发挥增强拟南芥针体功能(boyle et al.，2009)。苹果中的btb-back e3泛素连接酶mdpob1，通过泛素化降解mdpub29，从而抑制了苹果对轮纹病菌的抗性(han et al.，2019)。同样在苹果中，有研究报道苹果btb-taz蛋白mdbts调控mdbhlh从而影响苹果对铁的耐受性(zhao etal.，2016)。在拟南芥中，一个aht1基因作为crl3底物受体参与aba信号传导，编码区具有btb/poz结构域。aht1基因在甘露醇、nacl和干旱处理中诱导表达，缺失aht1基因会导致拟南芥种子萌发速度变缓，表现为与野生型相比缺失aht1基因的拟南芥植株根系较短，且子叶生长体积更小(kim et al.，2016)。拟南芥的btb-taz亚家族的五位成员中，atbt2作为骨架蛋白被研究地最多。atbt2不仅与雌雄配子体发育有关，并且响应营养物质、逆境和激素等多种信号。糖、aba、生长素会抑制bt2表达，乙烯、环境胁迫及施加氮源会促进其表达。bt2超表达可以减弱糖和aba对种子萌发的抑制作用，而bt2突变体对这一抑制作用更加敏感(mandadi etal.，2009)。有研究报道拟南芥中bt2具有抑制氮利用率、抑制硝酸盐吸收的功能(araus etal.，2016)。同时也有研究证明nlp直接激活bt1和bt2是拟南芥中硝酸盐反应分子机制的关键部分(sato et al.，2017)。
技术实现思路
1、为了解决上述问题，本发明提供了番茄slbtb6及其在提高植物干旱和高温耐受性中的应用。
2、首先，本发明提供番茄slbtb6蛋白，其为：
3、1)由seq id no.2所示的氨基酸组成的蛋白质；或
4、2)在seq id no.2所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1)衍生的蛋白质。
5、本发明还提供编码所述番茄slbtb6蛋白的基因。
6、优选的，所述基因的序列如seq id no.1所示。
7、本发明还提供含有所述基因的过表达载体，宿主细胞和工程菌。
8、本发明还提供所述基因在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用。
9、在本发明一个具体实施方案中，将所述基因构建到抑制表达载体中，转入植物基因组中，并使转基因植物中内源的btb6基因沉默表达，提高植物抗旱能力。
10、其中，优选的抑制表达载体为crispr-cas9载体。
11、本发明还提供所述基因在提高植物高温胁迫耐受性中的应用。
12、在本发明一个具体实施方案中，将所述基因构建到抑制表达载体中，转入植物基因组中，并使转基因植物中内源的btb6基因沉默表达，提高植物高温耐受能力。
13、其中，优选的抑制表达载体为crispr-cas9载体。
14、本发明还提供所述基因提高植物对干旱胁迫敏感性中的应用。
15、在本发明一个具体的实施方案中，将所述基因构建到超表达载体，转入植物基因组中，使所述基因在转基因植物中超表达后，提高植物对干旱胁迫敏感性。
16、本发明还提供所述基因提高植物高温胁迫敏感性中的应用。
17、在本发明一个具体的实施方案中，将所述基因构建到超表达载体，转入植物基因组中，使所述基因在转基因植物中超表达后，提高植物对高温胁迫敏感性。
18、本发明克隆了番茄slbtb6，该基因编码287个氨基酸。表达模式分析发现该基因主要在番茄根部、花和果实中表达，该基因受干旱、高盐、高温、低温及激素(aba，ja，br，mv)诱导表达。表明该基因的功能与非生物逆境密切相关。
19、本发明构建了超量表达载体和crispr-cas9敲除载体，通过农杆菌介导的遗传转化法将其转入到普通番茄ac中，成功获得slbtb6超表达番茄株系(oe)和crispr-cas9敲除株系(cr)。对转基因植株进行干旱处理表型观察，发现在正常浇水情况下，slbtb6转基因植株和野生型植株生长一致无明显差异；干旱处理后，与野生型番茄ac相比，slbtb6的oe植株在干旱处理中萎蔫时间更早，植株对干旱更加敏感；cr植株萎蔫时间较晚，提高了番茄的耐旱能力。生理生化分析结果表明，正常情况下slbtb6转基因植株和野生型植株相关生理指标无显著差异；干旱处理后与野生型相比，相对电导率值、丙二醛(mda)的含量在slbtb6超表达株系中较高，而在敲除株系中较低；超氧化物歧化酶(sod)、过氧化物酶(pod)、过氧化氢酶(cat)的酶活性以及脯氨酸(pro)含量在slbtb6超表达株系中较低，而在敲除株系中较高；dab、nbt染色显示超表达植株内h2o2和o2-富集程度均高于野生型，而敲除植株内的富集程度低于野生型。以上结果说明slbtb6超量表达降低了番茄的耐旱性，敲除slbtb6使得植株对干旱的耐受性提高，slbtb6是干旱负调控因子。
20、对slbtb6超表达番茄株系和crispr-cas9敲除株系进行了高温处理(40℃)并观察表型。结果显示：在常温(25℃)下slbtb6转基因植株和野生型植株生长一致无明显差异。在高温处理下，与野生型植株相比，slbtb6超表达番茄植株在高温处理中萎蔫速度更快，萎蔫情况更加严重；crispr敲除植株在高温处理在萎蔫时间更晚，萎蔫程度较轻。将高温处理后的植株移至常温进行恢复后，发现crispr敲除植株可基本恢复至正常生长水平，而部分slbtb6超表达番茄植株和野生型植株虽茎秆可恢复直立，但叶片已干枯萎蔫。进行相关生理生化指标测定，结果表明：在正常生长条件下slbtb6转基因植株和野生型植株的生理生化结果无明显差异。在高温处理后，与野生型相比，slbtb6超表达番茄植株的相对电导率、丙二醛含量、显著提高，sod、pod、cat酶活以及pro含量显著降低。crispr敲除植株的相对电导率、丙二醛含量相对于野生型显著较低，sod、pod、cat酶活以及pro含量显著较高。dab、nbt染色显示超表达植株内h2o2和o2-富集程度均高于野生型，而敲除植株内的富集程度低于野生型。以上结果说明slbtb6是高温负调控因子，超表达slbtb6降低了番茄植株对高温的耐受性。
1.番茄slbtb6蛋白，其为：
2.编码权利要求1所述的番茄slbtb6蛋白的基因。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，序列如seq id no.1所示。
4.含有权利要求2或3所述基因的载体。
5.含有权利要求4所述载体的宿主细胞。
6.含有权利要求2或3所述基因的工程菌。
7.权利要求2或3所述基因在提高植物干旱胁迫耐受性中的应用。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因构建到抑制表达载体中，转入植物基因组中，并使转基因植物中内源的btb6基因沉默表达，提高植物抗旱能力。
9.权利要求2或3所述基因在提高植物高温胁迫耐受性中的应用。
10.如权利要求7所述的用途，其特征在于，将所述基因构建到抑制表达载体中，转入植物基因组中，并使转基因植物中内源的btb6基因沉默表达，提高植物高温耐受能力。
