本发明属于生物，涉及高产乙醇的肺炎克雷伯菌活的非可培养状态的诱导和复苏及检测。
背景技术：
1、肺炎克雷伯菌(klebsiella pneumoniae，kpn)是医院内感染的重要病原菌，其具有广泛的耐药性、难以清除的问题日益受到关注。“物竞天择、适者生存”，当kpn处于不适合生长环境时(高盐浓度、抗生素、低浓度消毒)会形成一种活的非可培养状态(viable butnon-culturable state,vbnc state)，这是细菌的一种自我保护的生存方式和策略。在常规培养基上无法生长但仍然存活，等到环境适宜的时候会恢复可培养的状态。
2、在病人肠道中分离高产乙醇的肺炎克雷伯菌(high-alcohol-producingklebsiella pneumoniae，hialc kpn)产生大量内源性乙醇引起非酒精性脂肪肝病(nonalcoholic fatty liver disease,nafld)。其乙醇含量＞40mmol/l并且对氨基糖苷类抗生素、粘菌素、磷霉素和替加环素等多重耐药。
3、进入vbnc状态的hialc kpn广泛存在于医院污水，病房以及消毒不彻底的手术室，对患者、家属以及医务工作者带来潜在的健康威胁，所以迫切需要寻找诱导、复苏vbnc状态的条件和检测方法。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供高产乙醇的肺炎克雷伯菌活的非可培养状态的诱导和复苏及检测。
2、第一方面，本发明提供了一种体外获得进入vbnc状态肺炎克雷伯菌的方法(或者为制备vbnc状态肺炎克雷伯菌模型的方法)，包括如下步骤：
3、1)将肺炎克雷伯菌在4℃海盐溶液中进行无氧培养，得到培养产物，即为vbnc状态肺炎克雷伯菌。
4、上文所述方法中，所述海盐溶液(asw)的浓度为4-20％。
5、上文所述方法中，在步骤1)前还包括如下步骤：用4％的asw洗涤肺炎克雷伯菌。
6、上述质量体积百分含量20％的asw：将海盐以200g/l溶于去离子水中，然后经0.22μm的滤膜过滤制成。
7、上述质量体积百分含量4％的asw：将海盐以40g/l溶于去离子水中，然后经0.22μm的滤膜过滤制成。
8、上文所述方法还包括鉴定vbnc状态肺炎克雷伯菌的步骤2)：检测不同培养时间获得的培养产物，若在鉴定细菌的平板上无菌落形成，则该培养时间获得的培养产物为vbnc状态肺炎克雷伯菌。
9、上文所述检测不同培养时间获得的培养产物通过平板菌落计数法持续检测，鉴定细菌的平板为麦康凯琼脂平板。具体通过在麦康凯琼脂平板上计数1ml培养产物来确认vbnc状态细胞，并且在37℃下孵育48小时后没有任何菌落形成，证明vbnc状态诱导成功。
10、上文所述方法还包括检测vbnc状态肺炎克雷伯菌拷贝数的步骤3)(目的是从dna水平进一步鉴定vbnc状态肺炎克雷伯菌)：将所述vbnc状态肺炎克雷伯菌用pma染色后，再检测rpob基因或adhe基因拷贝数，根据所述rpob基因或adhe基因拷贝数确定所述vbnc状态肺炎克雷伯菌的拷贝数。
11、上文中，所述检测rpob基因或adhe基因拷贝数采用荧光定量pcr或ddpcr的方法进行。
12、所述检测rpob基因拷贝数采用的引物和探针依次为序列1-序列3所示的单链dna分子；
13、所述检测adhe基因拷贝数采用的引物和探针依次为序列4-序列6所示的单链dna分子。
14、上文所述方法中，所述pma染色的工作浓度为20μm，和/或，所述pma染色为黑暗下染色20分钟。
15、上文所述方法中，还包括vbnc状态肺炎克雷伯菌进行活死菌染色的步骤4)(目的是从活/死菌染色进一步鉴定vbnc状态肺炎克雷伯菌)，若染色结果含有活菌，则所述vbnc状态肺炎克雷伯菌存活。
16、上文所述方法中，还包括对vbnc状态肺炎克雷伯菌进行复苏后检测是否产乙醇的步骤5)(目的是从复苏后活力检测进一步鉴定vbnc状态肺炎克雷伯菌)，若复苏后产乙醇，则所述vbnc状态肺炎克雷伯菌有活力。
17、在本发明的实施例中，复苏是直接过夜培养或在含有环丙沙星、亚胺培南、多粘菌素和/或噬菌体phiw14的培养体系中培养6h后洗涤抗生素或噬菌体后继续过夜培养实现复苏。
18、上文所述方法还包括抑制所述vbnc状态肺炎克雷伯菌复苏的步骤6)：
19、将所述vbnc状态肺炎克雷伯菌在含有环丙沙星、亚胺培南、多粘菌素和/或噬菌体phiw14的培养体系中培养，实现抑制复苏。
20、上文中，所述环丙沙星在培养体系的浓度为3μg/ml、9μg/ml或18μg/ml，抑制复苏培养时间小于等于22小时；
21、所述亚胺培南在培养体系的浓度为3μg/ml、9μg/ml或18μg/ml，抑制复苏培养时间小于等于22小时；
22、所述多粘菌素在培养体系的浓度为18μg/ml，抑制复苏培养时间小于等于22小时；
23、所述多粘菌素在培养体系的浓度为3μg/ml和9μg/ml，抑制复苏培养时间小于9小时；所述噬菌体phiw14在培养体系为按照moi＝10-6加入待培养产物(1个噬菌体对应10的6次方菌液)，抑制复苏培养时间小于等于7小时。
24、第二方面，本发明提供了由第一方面所述方法获得的vbnc状态肺炎克雷伯菌。
25、第三方面，本发明提供了一种制备vbnc状态肺炎克雷伯菌模型的方法，包括第一方面所述方法的步骤。
26、第四方面，本发明提供了第一方面所述方法在制备检测待测样本中vbnc状态的hialc kpn中产品的应用。
27、为了解决现有的vbnc状态诱导、复苏和检测的技术问题，本发明从多因素研究影响高产乙醇肺炎克雷伯菌进入vbnc状态的形成与复苏、检测和绝对定量，确定了体外获得进入vbnc状态肺炎克雷伯菌的方法，实现了肺炎克雷伯菌诱导、检测和抑制复苏，可以准确定量vbnc状态的拷贝数。
1.一种体外获得进入vbnc状态肺炎克雷伯菌的方法，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述海盐溶液的浓度为4-20％。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：
6.根据权利要求3-5中任一所述的方法，其特征在于：
7.根据权利要求3-6中任一所述的方法，其特征在于：
8.根据权利要求3-7中任一所述的方法，其特征在于：
9.由权利要求1-8任一所述方法获得的vbnc状态肺炎克雷伯菌。
10.一种制备vbnc状态肺炎克雷伯菌模型的方法，包括权利要求1-8任一所述方法的步骤；
