本发明属于生物技术及兽用生物制品，具体涉及一种非瘟病毒疫苗制备方法和该疫苗在非洲猪瘟检测防疫领域的应用。
背景技术：
1、非洲猪瘟(african swine fever,asf)，是由非洲猪瘟病毒(african swinefever virus)asfv引起的猪的一种急性、热性、高度接触性传染病，其常表现出全身出血、呼吸障碍和神经症状等临床症状，具有病程时间短、高病死率等特征，在家猪中导致的死亡率接近100％，因此将其列为一类传染病，同时该病也是世界动物卫生组织(oie)的法定报告动物疫病之一。非洲猪瘟的传播和疫情的出现，对养猪生产已构成严重威胁，带来了巨大的经济损失，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。
2、非洲猪瘟(asf)的病原是非洲猪瘟病毒(asfv)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。asfv主要以家猪/野猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟科非洲猪瘟病毒属的重要成员，病毒有些特性类似虹彩病毒科和痘病毒科。病毒粒子的直径为175－215纳米，呈20面体对称，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。asfv基因组为双股线状dna，大小170－190kb，编码蛋白超过150种。在猪体内，非洲猪瘟病毒可在几种类型的细胞浆中，尤其是网状内皮细胞和单核巨噬细胞中复制。该病毒可在钝缘蜱中增殖，并使其成为主要的传播媒介。asfv基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组共有150多个开放阅读框，共编码100多种多肽，编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白，其中，结构蛋白p72和cd2v可分别用于进行基因型和血清型分析。p72蛋白参与病毒二十面体核衣壳形成，主要衣壳蛋白，具有一个能够诱导机体产生中和抗体的构象中和表位。cd2v蛋白位于病毒粒子的外囊膜上，由信号肽序列和一个跨膜区组成，因为它拥有两个免疫球蛋白样的结构域，其氨基酸序列与cd2分子非常相似，可以与猪红细胞表面的cd2受体发生特异性结合，因此asfv可以吸附在猪的红细胞表面，具有血吸附性。具有血吸附性的非洲猪瘟病毒，在感染时90％的病毒粒子呈红细胞吸附的状态，这种现象可能与非洲猪瘟病毒在猪体内的传播有关。p30蛋白在病毒感染早期表达，能够引起机体免疫反应，因此该蛋白具有比较好的抗原性。p54蛋白无糖基化，有一段跨膜区，定位于内质网诞生的膜蛋白前体处。ep153r蛋白与宿主细胞相互作用蛋白、类c型血凝素蛋白、调节宿主细胞功能、不影响病毒的致病性，含有中央跨膜区，c型凝集素样结构(c-type lectin)和细胞附着序列，蛋白中潜在多个n-糖基化、磷酸化和豆蔻酰化位点，抑制细胞凋亡。k205r蛋白较早刺激机体产生抗体，有较强的抗原抗体反应。b602l蛋白是p72分子伴侣蛋白，参与p72核衣壳蛋白的折叠。a238l蛋白具有抑制转录因子nf-b和nf-at，辅助因子cbp/p300的活性的功能，从而抑制炎症因子和免疫调节因子如tnf-，cox-2等基因的转录表达。a104r蛋白是构成asfv粒子结构的蛋白、类组氨酸结构蛋白、hf类dna结合蛋白。
3、目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，对防御非洲猪瘟具有重大意义。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种非洲猪瘟疫苗及其制备方法。
2、在一些方面，本文提供下述任一项描述的发明。
3、1、一种针对非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)asfv的疫苗，所述疫苗包括首针mrna疫苗和加强针亚单位疫苗。
4、2、根据1所述的非洲猪瘟疫苗，所述亚单位疫苗中含有ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原，所述抗原为纯化抗原；
5、所述抗原mrna为通过t7 rna聚合酶在体外转录获得。
6、3、根据1-2任一项所述的非洲猪瘟疫苗，所述ep153r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:1所示，编码所述cd2v抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:2所示，编码所述p72抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:3所示，编码所述p30抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:4所示，编码所述p54抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:5所示，编码所述k205r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:6所示，编码所述b602l抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:7所示，编码所述a238l抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:8所示，和编码所述a104r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:9所示；
7、编码所述ep153r抗原的dna碱基序列如seq id no:10所示，编码所述cd2v抗原的dna碱基序列如seq id no:11所示，编码所述p72抗原的dna碱基序列如seq id no:12所示，编码所述p30抗原的dna碱基序列如seq id no:13所示，编码所述p54抗原的dna碱基序列如seq id no:14所示，编码所述k205r抗原的dna碱基序列如seq id no:15所示，编码所述b602l抗原的dna碱基序列如seq id no:16所示，编码所述a238l抗原的dna碱基序列如seqid no:17所示，和编码所述a104r抗原的dna碱基序列如seq id no:18所示。
8、4、根据1-3任一项所述的亚单位疫苗，所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.04mg/ml；
9、所述mrna疫苗含有的所述抗原的mrna浓度为0.05-0.5mg/ml，优选为0.5mg/ml。
10、5、根据1-4任一项所述的非洲猪瘟疫苗，所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原之间所含比例及编码所述抗原的所述mrna之间所含比例为任意比例混合，优选为1:1:1:1:1:1:1:1:1。
11、6、1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的制备方法，所述亚单位疫苗的制备方法包括筛选并分离所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原的蛋白序列，将编码所述蛋白序列的dna碱基序列进行密码子优化，在工程细胞株中表达，获得相应抗原，优选地，将获得的ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原与佐剂体积比为1:1混合，获得所述亚单位疫苗；
12、所述mrna疫苗的制备方法包括通过t7 rna聚合酶在体外转录获得抗原mrna，纯化定量后利电荷之间相互作用，最终形成包裹mrna的阳离子脂质纳米颗粒mrna-lnps，经浓缩获得mrna疫苗。
13、7、1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的应用所述非洲猪瘟疫苗可用于防疫非洲猪瘟；
14、所述亚单位疫苗可单独使用，也可作为序贯免疫加强针使用；
15、所述mrna疫苗可单独使用，也可作为序贯免疫首针疫苗使用。
16、8、1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，疫苗首针为mrna疫苗，加强针为同抗原的亚单位疫苗。
17、9、根据权利要求1-6任一项所述的非洲猪瘟疫苗在制备防疫非洲猪瘟的制品中的应用，所述制品包括，例如疫苗、药品、诊断试剂盒等。
18、为解决现有技术中存在的问题，在一方面，本发明分析并筛选了非洲猪瘟病毒中60余种抗原蛋白，并制备成苗进行猪体免疫，在二次免疫后，收集猪血液分离血清和外周血淋巴细胞，分别用免疫抗原蛋白进行抗体水平检测和ifn-γ试剂盒进行细胞因子水平检测，确定能够引起高抗体水平和高细胞因子水平的抗原，制备成序贯免疫后作为疫苗加强针，同时分析抗原蛋白序列，从合成dna开始、转录成mrna并大规模生产mrna，进行包封，最终制成首针疫苗，mrna疫苗和亚单位疫苗同时送至国外进行免疫与攻毒。以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
1.一种针对非洲猪瘟病毒(african swine fever virus)asfv的疫苗，其特征在于，所述疫苗包括首针mrna疫苗和加强针亚单位疫苗。
2.根据权利要求1所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述亚单位疫苗中含有ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原，所述抗原为纯化抗原；
3.根据权利要求1-2任一项所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述ep153r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:1所示，编码所述cd2v抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:2所示，编码所述p72抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:3所示，编码所述p30抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:4所示，编码所述p54抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:5所示，编码所述k205r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:6所示，编码所述b602l抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:7所示，编码所述a238l抗原的亚单位氨基酸序列如seq idno:8所示，和编码所述a104r抗原的亚单位氨基酸序列如seq id no:9所示；
4.根据权利要求1-3任一项所述的亚单位疫苗，其特征在于，所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原浓度为0.01-1mg/ml，优选为0.04mg/ml；
5.根据权利要求1-4任一项所述的非洲猪瘟疫苗，其特征在于，所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原之间所含比例及编码所述抗原的所述mrna之间所含比例为任意比例混合，优选为1:1:1:1:1:1:1:1:1。
6.权利要求1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的制备方法，其特征在于，所述亚单位疫苗的制备方法包括筛选并分离所述ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原的蛋白序列，将编码所述蛋白序列的dna碱基序列进行密码子优化，在工程细胞株中表达，获得相应抗原，优选地，将获得的ep153r抗原、cd2v抗原、p72抗原、p30抗原、p54抗原、k205r抗原、b602l抗原、a238l抗原、a104r抗原与佐剂体积比为1:1混合，获得所述亚单位疫苗；
7.权利要求1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，所述非洲猪瘟疫苗可用于防疫非洲猪瘟；
8.权利要求1-5任一项所述的非洲猪瘟疫苗的应用，其特征在于，疫苗首针为mrna疫苗，加强针为同抗原的亚单位疫苗。
9.根据权利要求1-6任一项所述的非洲猪瘟疫苗在制备防疫非洲猪瘟的制品中的应用，所述制品包括，例如疫苗、药品、诊断试剂盒。
