本发明属于农作物病害鉴定，具体涉及一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法。
背景技术：
1、选育抗病品种被认为是最直接且经济有效的防治青枯病的方法。选育抗病品种的第一步就是对品种的青枯病抗性进行鉴定。目前所用的花生青枯病鉴定方法主要有病圃鉴定、浇菌法、剪叶法、注茎法、水培接菌法等。病圃鉴定一般在田间花生生长期进行，一年鉴定一次。浇菌法和剪叶法可用于田间和室内，但是田间鉴定结果受多种因素影响导致鉴定结果不准确，室内鉴定又需要大规模种植。水培接菌法一般用于室内鉴定，需要生长间、水培体系等，鉴定时间需30-45天。这些鉴定方法多以存活率作为鉴定指标，抗性弱的植株死亡，不适于抗性弱但需繁种的品种进行鉴定。目前急需建立简单、高效、快速、对植株的正常生命活动无影响的高通量青枯病鉴定方法。
2、现有技术中，专利文献cn112111550a提供了一种花生青枯病抗性分级的鉴定方法，使用枝条进行青枯病菌接种；cn103194524b提供了一种快速鉴定青枯病花生种质的方法，使用茎枝接种青枯病。上述文献的鉴定方法在实践中存在着样品不易发病、成功率低的不足。
3、鉴于此，提出本发明。
技术实现思路
1、针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，使用离体叶片进行培养，鉴定方法简单，准确可靠。
2、为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
3、一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，包括如下步骤：
4、(1)花生种植：种植花生，得花生植株；
5、(2)菌液培养：将花生青枯病菌接种到含2,3,5-氯化三苯基四氮唑的lb培养基平板上进行培养；培养完成后，挑选中间红色四周白色的单克隆于lb液体培养基中再次摇床培养，得细菌液；
6、(3)叶片取样：用干净剪刀剪取步骤(1)中花生植株上的羽状复叶，再将每片小叶基部剪去后放入培养皿(培养皿可采用常用的材质和形式即可，如玻璃或塑料均可，本发明中选用直径为9cm的塑料圆形培养皿)，待用；
7、(4)青枯病菌接种：将步骤(2)所得细菌液加入步骤(3)所得培养皿中，使细菌液浸没叶片基部；
8、(5)发病情况统计：利用步骤(4)中加入细菌液后的培养皿进行培养；随后观察发病情况并确定花生品种的抗病性。
9、上述技术方案中，先进行花生的种植，然后利用青枯病菌接种到离体的叶片伤口，最后观察发病情况，即可根据统计公式得到抗病性等级。需要特别说明的是，步骤(1)中提到的花生种植，可以在田间或室内按常规方法种植，常规水肥管理即可，本发明中对其并无要求，且花生种植的目的是获取待评估花生样本，其种植方法并不会对评估结果产生直接影响。因此，本发明中并不对其具体种植方法进行限定或描述，以本领域技术人员能够实现为准。需要特别强调的是，步骤(3)中，“将每片小叶基部剪去”这一操作十分关键，对于青枯病菌接种的发病率十分重要。
10、作为本发明技术方案的进一步优选，步骤(2)中，2,3,5-氯化三苯基四氮唑的浓度为0.03～0.1g/l；更优选地，2,3,5-氯化三苯基四氮唑的浓度为0.05g/l；
11、lb固体培养基的成分为：牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，琼脂15g/l，纯水1l；
12、lb液体培养基的成分为：牛肉膏5g/l，蛋白胨10g/l，氯化钠10g/l，纯水1l。
13、作为本发明技术方案的进一步优选，步骤(2)中，lb培养基平板上的培养温度为26～30℃，培养时间为24～72h；优选地，培养温度为28℃，培养时间为48h；
14、摇床培养的温度为26～30℃，转速为180～250rpm，培养至od值为1.6～2.0；优选地，培养温度为28℃，转速为200rpm；需要特别强调的是，接种用的细菌浓度与发病快慢有关，od为1.6～2.0时16h开始出现病斑，2～3天后整个叶片全部坏死；od为0.5～0.8时36h开始出现病斑，3～5天后整个叶片全部坏死。
15、作为本发明技术方案的进一步优选，步骤(4)中，加入细菌液时，培养皿与桌面或地面成15～30度倾斜。具体来说，可以进行操作：培养皿放入底盘内，底盘另一侧用白枪头盒垫高与桌面成15～30度倾斜，使细菌液浸没叶片基部伤口，盖回培养皿盖。
16、作为本发明技术方案的进一步优选，步骤(5)中，培养温度为室温。
17、作为本发明技术方案的进一步优选，步骤(5)中，确定花生品种的抗病性包括：先按照叶片病斑的多少确定发病等级，随后再根据发病等级计算病情指数，最后根据病情指数划分抗性等级。
18、作为本发明技术方案的进一步优选，发病等级的划分标准如下：
19、0级：叶片无病斑，无发病症状；
20、1级：接种叶片出现不超过1/4叶片面积的病斑；
21、2级：接种叶片出现1/4-1/2叶片面积的病斑；
22、3级：接种叶片出现1/2-3/4叶片面积的病斑；
23、4级：接种叶片全部出现病斑。
24、作为本发明技术方案的进一步优选，病情指数的计算采用如下公式：
25、病情指数＝[σ(各级病叶数×相应病级数)/(总叶数×最高病级数)]×100。
26、作为本发明技术方案的进一步优选，抗性等级的划分标准如下：
27、高抗：病情指数≤15；
28、中抗：15＜病情指数≤45；
29、感病：45＜病情指数≤75；
30、高感：病情指数＞75。
31、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
32、(1)本发明提供的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，可以在田间或者室内取样，室内花生生长10天左右到三叶期以上均可鉴定，不受大田其他条件影响，鉴定准确可靠。
33、(2)本发明提供的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，所涉及到的操作步骤均为实验室操作方法，操作简单，发病快，效率高，3～5天左右即可获得鉴定结果。
34、(3)本发明提供的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，只取花生羽状复叶，对花生整株的生命活动基本无影响，是一种无损鉴定方法。
35、(4)本发明提供的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，所提供的发病等级以及青枯病的抗病性鉴定划分标准简单可靠，适用性强。
36、总之，本发明提供的一种离体花生叶片鉴定青枯病抗病性的鉴定方法简单、实用性强，具有极强的实践指导意义。
1.一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中，2,3,5-氯化三苯基四氮唑的浓度为0.03～0.1g/l；
3.根据权利要求1所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(2)中，lb培养基平板上的培养温度为26～30℃，培养时间为24～72h；摇床培养的温度为26～30℃，转速为180～250rpm，培养至od值为0.5～2.0。
4.根据权利要求1所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(4)中，加入细菌液时，培养皿与桌面或地面成15～30度倾斜。
5.根据权利要求1所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(5)中，培养温度为室温。
6.根据权利要求1～5任一项所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，步骤(5)中，确定花生品种的抗病性包括：先按照叶片病斑的多少确定发病等级，随后再根据发病等级计算病情指数，最后根据病情指数划分抗性等级。
7.根据权利要求6所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，发病等级的划分标准如下：
8.根据权利要求6所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，病情指数的计算采用如下公式：
9.根据权利要求6所述的一种利用花生离体叶片进行青枯病抗性鉴定的方法，其特征在于，抗性等级的划分标准如下：
