本发明属于生物领域；尤其涉及一种从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法。
背景技术：
1、随着生活水平的提升，人们对生活品质的需求也日益提升，有“抗氧化界的爱马仕”之称的麦角硫因也成了市场的追捧。麦角硫因(egt)因自身的结构特性而具有良好的生物活性，可维持dna的生物合成、抗氧化、清除自由基、防御细胞凋亡、保护线粒体、参与能量调节等多种功效。目前已被广泛应用于食品、医药和化妆品领域。现有相关egt产品通过gras认证。专业人士预测在不久的将来，该产品将有数百吨规模需求。
2、卖角硫因的制备方法主要包括：有化学合成法、天然生物提取法、生物合成法；其中，生物合成法包括：固体发酵和液体深层发酵。液体发酵法是目前行业生产主流，但发酵水平大多在克/升规模，生产水平相对并不高。目前液体发酵法提取麦角硫因报道主要如下：
3、姜文霞等(专利号cn104774182b)报道了一种提取麦角硫因的方法，主要以热水浸提蕈菌菌丝体发酵液，获得菌丝体和麦角硫因水溶液，然后对所述麦角硫因水溶液以截留分子量为1kda～30kda的超滤膜进行超滤，并收集超滤透过液，hilic色谱纯化，流动相组成为体积比80∶20～88∶12的乙腈-水，麦角硫因进样量为每100g填料0.01g～0.323g,制备的erg纯度可达99％。但是该方法在制备过程中使用了大量的乙腈有机溶剂。
4、佟丽(专利cn113666873a)报道了一种工业制备高纯度麦角硫因的方法，主要包括将菌丝体热水处理后固液分离，收集得到含有麦角硫因的料液；将含有麦角硫因的料液进行真空浓缩，0.1um微滤膜过滤，3～4kda超滤，阴离子交换树脂(hz214/d296)脱色，阳离子树脂(hz001)吸附、水洗解吸，色谱填料层析，浓缩；将麦角硫因解吸浓缩液进行色谱纯化，收集目标峰并浓缩至干，水溶解后得到麦角硫因样液；将麦角硫因样液过离子交换树脂脱盐脱色，收集得到麦角硫因脱盐浓缩液；将麦角硫因脱盐浓缩液粗结晶和重结晶，烘干，得到高纯麦角硫因晶体粉末；但该技术涉及多次离子交换及层析，处理工段复杂，成本高，易导致产品收率低。
5、张山等(专利号cn 116143699a)报道了一种从发酵液中纯化麦角硫因的方法，第一步发酵液中添加絮凝剂，压滤得滤液；第二步将步骤一所得压滤液用超滤膜过滤，得到超滤液；第三步将步骤二得到的超滤液上大孔树脂柱，收集流出液；第四步将步骤三得到的流出液浓缩，向浓缩液中加入一定浓度的金属盐溶液，静置离心得沉淀，向沉淀中滴加竞争性络合剂，释放麦角硫因，离心得到上清液；第五步将步骤四的上清液浓缩后放置结晶，过滤、洗涤和烘干滤饼，得到所述麦角硫因纯品，其最终获得的产品纯度＞98％且回收率＞90％。但该技术的制备方法操作过程中金属盐的加入量难以精准控制，且易产生大量含金属盐的废水。
6、陈青来(专利号cn 115536590a)报道了一种麦角硫因的制备方法，包括如下步骤：步骤1，将菌丝体加入水中蒸煮20～30min，冰冻10～20min，然后低温碎化并溶解过滤，得到过滤液与沉淀；步骤2，将沉淀放入乙醇水溶液中恒温提取30～60min，超声分散20～30min，过滤得到醇提液；步骤3，将醇提液与水提液合并搅拌，并恒温减压蒸馏2～3h，然后降温过滤，并二次减压蒸馏，过滤得到浓缩清液；步骤4，将浓缩清液通入超滤膜进行超滤处理，然后滤液进行树脂(聚酰胺)交换吸附，得到洗脱液，最后将洗脱液喷雾干燥，最终得到麦角硫因。但该方法主要局限于胞内表达的菌丝体。
7、近些年，随着市场容量的扩大及技术的革新，生物发酵法逐步成为行业的主流，从初始毫克每升级别到现在克每升级别。但相对其它产品其生产水平仍然有局限，目前提取工艺大多局限在离子交换及有机溶剂萃取等。因此如何从发酵结束后的发酵液中分离纯化获得高纯度的目标产物erg对产业化而言至关重要。
技术实现思路
1、本发明的目的是提供了一种从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法。本发明采用一步层析法代替现有多次离交技术，整体而言，本发明所使用分离填料价格便宜，成本低，生产过程简单，生产周期短，过程中使用的乙醇洗脱剂可回收利用，且产品损失少，收率高，可规模化生产。
2、本发明是通过以下技术方案实现的：
3、本发明涉及一种从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，依次进行以下步骤：预处理，除菌，超滤，第一次浓缩，柱层析，第二次浓缩，脱色，析晶。
4、优选地，本发明所涉及的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法的具体包括：
5、步骤1，预处理：酸对微生物发酵液进行调节ph至2.5～3.0，搅拌0.5～1.0小时，碱回调ph至5.5～6.0；
6、步骤2，除菌：对调节ph后的液体离心或者微滤进行固液分离；
7、步骤3，超滤：对除菌后的清液进行超滤去除蛋白等大分子物质；
8、步骤4，第一次浓缩：对超滤后的料液进行多效浓缩或纳滤浓缩；
9、步骤5，柱层析：将浓缩后的料液过层析柱进行层析，并用流动相a与b进行梯度洗脱，收集含麦角硫因的目标组分；
10、步骤6，第二次浓缩：针对洗脱出的料液旋蒸或纳滤继续浓缩至相应固含量；
11、步骤7，脱色：采用物质c对料液脱色处理；
12、步骤8，析晶：采用乙醇进行析晶。
13、优选地，步骤1中，所述微生物发酵液为大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌微生物发酵后产生麦角硫因的发酵液。
14、优选地，步骤1中，所述酸为盐酸、醋酸或甲酸；优选盐酸。
15、优选地，步骤1中，所述碱为naoh或koh；优选naoh。
16、优选地，步骤2中，所述离心采用碟片离心机加板框压滤方式或管式离心机离心；所述微滤采用陶瓷膜微滤。
17、优选地，步骤3中，所述超滤采用1kda的超滤卷式膜进行超滤。
18、优选地，步骤4中，所述第一次浓缩采用旋蒸浓缩、多效蒸发浓缩或纳滤浓缩，其纳滤膜为200da。
19、优选地，步骤5中，所述层析柱为100～200目的硅胶填料或氧化铝填料，优选氧化铝填料，所述洗脱剂a为乙醇或甲醇，优选乙醇，浓度为50～70％，洗脱剂b为氨水，浓度为1～3％，洗脱流速控制为0.3～0.5bv/h。
20、优选地，步骤6中，所述第二次浓缩采用旋蒸浓缩、多效蒸发浓缩或纳滤浓缩，其纳滤膜为200da。
21、优选地，步骤7中，所述物质c为活性炭或树脂xrts2；优选树脂xrts2。
22、优选地，步骤8中，所述乙醇的终浓度为65～80％，所述析晶加入过程需搅拌，其中加入流速为1.0～1.5倍料液体积/小时。
23、本发明具有以下优点：
24、(1)本发明在纯化制备麦角硫因过程中，使用柱层析，其使用的洗脱剂为乙醇，可通过旋蒸浓缩回收套用；本发明方法不仅简化生产环节，缩短生产周期，有效提升生产效率；而且提升产品纯度及收率，纯度高达98％以上，收率高达80％以上。
25、(2)本发明所涉及的分离纯化方法，该技术操作简单，成本低，可实现产业化。
1.一种从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，依次进行以下步骤：预处理，除菌，超滤，第一次浓缩，柱层析，第二次浓缩，脱色，析晶。
2.如权利要求1所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤具体包括：
3.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤1中，所述微生物发酵液为大肠杆菌、酿酒酵母、谷氨酸棒状杆菌微生物发酵后产生麦角硫因的发酵液；所述酸为盐酸、醋酸或甲酸；所述碱为naoh或koh。
4.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤2中，所述离心采用碟片离心机加板框压滤方式或管式离心机离心；所述微滤采用陶瓷膜微滤。
5.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤3中，所述超滤采用1kda的卷式膜进行超滤。
6.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤4中，所述第一次浓缩采用旋蒸浓缩、多效蒸发浓缩或纳滤浓缩，其纳滤膜为200da。
7.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤5中，所述层析柱为100～200目的硅胶填料或氧化铝填料，所述洗脱剂a为乙醇或甲醇，浓度为50～70％；洗脱剂b为氨水，浓度为1～3％，洗脱流速为0.3～0.5bv/h。
8.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤6中，所述第二次浓缩采用旋蒸浓缩、多效蒸发浓缩或纳滤浓缩，其纳滤膜为200da。
9.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤7中，所述物质c为活性炭或树脂xrts2。
10.如权利要求2所述的从发酵液中分离纯化麦角硫因的方法，其特征在于，步骤8中，所述乙醇的终浓度为65～80％，所述析晶加入过程需搅拌，其中加入流速为1.0～1.5倍料液体积/小时。
