本发明属于生物，涉及一种3-乙酰基呕吐毒素水解酶及其应用。
背景技术：
1、乙酰基呕吐毒素(acetyldeoxynivalenol，adon)是呕吐毒素(deoxynivalenol，don)真菌生物合成过程中的中间体，但adon并不能完全转化为don，因此，don污染的粮食和饲料通常也同时受到adon污染。相关调查报告表明，adon在饲料原粮中的检出率可达87％，检出水平高达300～1000μg/kg。
2、与don相比，adon极性较小，可能通过口服吸收更易进入人体和动物体内，对健康的危害也更大。根据don和adon对老鼠急性致死率以及体内adon转化率的试验数据，联合国粮农组织和世卫组织食品添加剂专家联合委员会(jecfa)认为adon的毒性与don相当。因此，jecfa将之前设定的1μg·kg-1bw的don每日暂定最大耐受摄入量(pmtdi)调整为don和adon的联合pmtdi。此外，基于人肝癌细胞hepg2和猪小肠上皮细胞ipec-1的体外毒性试验表明，don、3-adon和15-adon毒素之间组合具有毒性协同效应。
3、作为一种隐蔽型真菌毒素，adon可以在人类和动物的消化系统、肾脏和肝脏等组织器官的代谢的作用下水解生成don，从而增加don的暴露风险和代谢负担。综上所述，无论是adon的污染率、污染水平还是其本身的毒性作用，都已达到不容忽视的程度，对人类和动物健康构成严重威胁。因此，有必要采取有效的措施来控制adon的污染。在真菌毒素降解研究领域，利用微生物或者酶进行生物脱毒是一种安全、环保且高效的方法，例如，cn108251388a公开了一种呕吐毒素降解酶及其基因，提供的呕吐毒素降解酶可以高效且快速地降解呕吐毒素。然而，针对乙酰基呕吐毒素的脱毒技术却相对缺乏，因此，开发乙酰基呕吐毒素脱毒技术具有重要意义。
技术实现思路
1、针对现有技术的不足和实际需求，本发明发现了一种新型α/β水解酶，该酶具有水解隐蔽型真菌毒素3-adon而生成呕吐毒素的活性。将此酶与呕吐毒素脱氢酶进行融合表达，融合酶可同时将呕吐毒素及3-adon转化为低毒产物3-酮基呕吐毒素，从而实现“一酶解两毒”的效果。
2、为达上述目的，本发明采用以下技术方案：
3、第一方面，本发明提供一种3-乙酰基呕吐毒水解酶，所述酶具有将隐蔽型真菌毒素3-乙酰基呕吐毒水解为呕吐毒素的活性，所述酶的氨基酸序列包括：
4、(1)seq id no.1所示的序列，或，
5、(2)与seq id no.1所示序列具有至少85％序列同源性，且与seq id no.1所示序列功能相同或相似的氨基酸序列，或，
6、(3)由seq id no.1所示序列经取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基获得，且与seq id no.1所示序列功能相同或相似的氨基酸序列。
7、本发明采用同源比对策略，以已报道的植物源乙酰基呕吐毒素水解酶bdcex29(xp_003568581)为查询序列，在德沃斯氏菌的本地基因组进行tblastn搜索，获得一个与bdcex29氨基酸序列同源性仅为22.7％的新型α/β水解酶dea5。通常情况下，两个酶氨基酸序列同源性达到30％以上，才可能具有相同催化功能。但实验结果发现，尽管同源性仅为22.7％，dea5仍具有可催化3-adon水解为呕吐毒素的活性。基于该发现，本发明将新获得的dea5水解酶与现有的呕吐毒素脱毒酶adh进行融合表达，得到融合酶dea5-adh。该融合酶可先将3-adon水解为don，依次将don氧化为低毒产物3-keto-don，从而实现3-adon的脱毒。
8、可以理解，本技术发现了来源于德沃斯氏菌的酶(氨基酸序列如seq id no.1所示)具备水解3-adon的功能，那么德沃斯氏菌或近缘菌株中的序列及功能与seq id no.1所示序列相同或相似的酶均能预期其具备3-adon水解活性，此外，利用本领域通用技术手段对seq id no.1所示序列进行取代、缺失或添加一个或至少两个氨基酸残基改造而获得的酶，同时功能与原蛋白相同或相似，亦可预期其具备3-adon水解活性。
9、seq id no.1：
10、maspeahieiarlfaerqeedvplaiarrnweeeagklplpegaqfkpviadgvpsewmdmpgsdprrvflflhgggynagspkthrklaallaqatgtrvlmpdyrlapehpfpaavkdallafgwllsegfkpsdiivggdsaggglalsmllalreagaempraavllapwtdltvsslsyarlrendpiivperlrragtwyagrrdprdpmaspmfadlaglppmlihagtnevmlddsavfaeraqaagcdvtfkiwpelwhvfhhaaldvpeaseaiaeigayvhraydrp。
11、第二方面，本发明提供一种3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因，所述3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因编码第一方面所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶。
12、优选地，所述3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因的核酸序列包括seq id no.2所示的序列。
13、seq id no.2：
14、atggcgagtccggaagcacatatcgagatcgcacgcctgtttgccgagcggcaagaggaggatgtgccgttggccatcgcccgccgcaactgggaggaagaggccggcaagctgccgctgcccgagggtgcgcagttcaagccggtcatagccgacggcgttccgtccgaatggatggatatgcccggctccgatccccgccgggttttcctgttcctgcatggaggcggctacaatgccggctcgcccaagacgcaccgcaagctcgccgcgctcctggcgcaggcaaccgggacgcgcgtgctcatgcccgattatcgcctggcgcccgagcacccctttcccgccgcagtcaaggatgcgcttctcgccttcggttggctgctgagcgaggggttcaaaccgtccgatatcatcgtgggcggtgattccgccggcggcgggctcgccctttcgatgctgctcgccttgcgcgaggcgggcgcggagatgccgcgcgccgcagtgctgctggcgccctggacggatctcaccgtttccagcctctcctacgcacgcctgcgcgagaatgatccgatcatcgtgcccgagcggcttcggcgcgccggcacatggtatgccggccgccgcgatccgcgcgatcccatggcgtccccgatgttcgccgatctggccggcctgccgcccatgttgatccatgccggcaccaatgaggtgatgctcgatgatagcgcggtcttcgccgaacgcgcccaggcggcgggctgcgatgtgacgttcaagatctggcccgagctttggcatgtcttccatcacgctgcgctggacgttcccgaggcgtcggaggcgatagccgagatcggcgcctatgtgcacagggcctacgatcgcccatga。
15、第三方面，本发明提供一种重组表达载体，所述重组表达载体含有第二方面所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因。
16、第四方面，本发明提供一种重组工程菌株，所述重组工程菌株含有第三方面所述的重组表达载体。
17、第五方面，本发明提供一种融合酶，所述融合酶含有第一方面所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶和呕吐毒素(don)脱毒酶。
18、本发明中，发现一个新的3-乙酰基呕吐毒素(3-adon)水解酶，该水解酶能够催化3-adon水解为呕吐毒素。进而，通过将该新发现的3-adon水解酶与呕吐毒素脱毒酶构建融合酶，实现了直接将3-adon降解为低毒代谢产物3-keto-don的目的。
19、优选地，所述呕吐毒素脱毒酶包括呕吐毒素脱氢酶。
20、优选地，所述呕吐毒素脱氢酶的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。
21、seq id no.3：
22、mqhadgaaaetaapgqsaienfqpvtaedlaggnaanwpilrgnyqgwgytqldqinkdnvgqlqlawartmepgsnegsaiayngvvflgnandvvqaidgktgnliweyrrklppaskfinslgaakrsialfgdkvyfvswdnfvvaldaktgklawetnrgqgveegvsnssgpivvdgvviagstcqysgfgcyvtgtdaesgeelwrntfiprpgeegddtwggapyenrwmtgawgqitydpeldlvyygstgagpasevqrgteggtlagtntrfavkpktgevvwkhqtlprdnwdsectfemmvvsttvnpdagadgmmsvganvprgetrkvltgvpcktgvawqfdaetgdyfwskatveqnsiasiddkglvtvnedmilkepgkdynycptflggrdwpsagylpksnlyviplsnacydlkartteatpadvyntdstvklapgktnmgrvdaidvatgatkwsfeteaalydpvmttagdlvfvgstdrmfraldaetgkevwstrlpgaisgyttsysidgrqyvavvaggslgtgffkaavpgvdavqggngiyvfalpeak。
23、本发明中，所述融合酶中可以以3-adon水解酶的c端连接don脱毒酶的n端，两个酶之间还包括连接肽如gggggggg。
24、本发明中，将第一方面所述酶和具有将don氧化为低毒性产物3-keto-don的don脱氢酶(pqq-dependent alcohol dehydrogenase，吡咯喹啉醌依赖性醇脱氢酶)成功进行了融合表达，结果表明该融合酶不仅能将don氧化为低毒3-keto-don又能将3-adon氧化为3-keto-don(实际过程是3-adon先水解为don，don再经过don脱氢酶氧化为低毒3-keto-don)，实现了“一酶解两毒”的效果，为粮食和饲料原粮中呕吐毒素及adon污染问题提供了解决方案。
25、第六方面，本发明提供第一方面所述的3-adon水解酶或第五方面所述的融合酶在水解3-adon(隐蔽型真菌毒素)中的应用，所述3-adon水解酶催化3-adon水解为呕吐毒素。
26、第七方面，本发明提供一种降解3-adon的方法，所述方法包括：
27、将含3-adon与降解酶接触，进行反应；所述降解酶包括第一方面所述的3-adon水解酶。
28、优选地，所述反应温度为15～30℃，包括但不限于16℃、17℃、18℃、19℃、20℃、23℃、25℃、26℃、28℃或29℃等，ph为7～8.5，包括但不限于7.5或8等等。
29、优选地，所述降解酶还包括呕吐毒素脱毒酶。
30、优选地，所述呕吐毒素脱毒酶包括呕吐毒素脱氢酶。
31、优选地，所述呕吐毒素脱氢酶的氨基酸序列包括seq id no.3所示的序列。
32、优选地，所述降解酶为第五方面所述的融合酶。
33、第八方面，本发明提供第一方面所述的3-adon水解酶或第五方面所述的融合酶在制备降解3-adon的产品中的应用。
34、第九方面，本发明提供一种添加剂，所述添加剂包括第一方面所述的3-adon水解酶或第五方面所述的融合酶。
35、本发明中，发现了能够水解隐蔽型真菌毒素3-adon而生成呕吐毒素的酶，并进一步开发融合酶，能够同时将don和3-adon降解为低毒产物3-keto-don，可见，所述3-adon水解酶和融合酶有望作为添加剂，添加在粮油或饲料等产品中，用于降解其中的将don和3-adon。
36、与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
37、本发明发现了一种新型α/β水解酶，该酶能够水解隐蔽型真菌毒素3-adon而生成呕吐毒素，这为隐蔽型真菌毒素的生物脱毒提供了新的思路；
38、本发明提供了一种将新型α/β水解酶与呕吐毒素脱毒酶融合表达的融合酶，该融合酶可同时将don和3-adon降解为低毒产物3-keto-don，这实现了“一酶解两毒”的效果，为粮食和饲料原粮中呕吐毒素及隐蔽型呕吐毒素(3-adon)污染问题提供了新的解决方案；
39、本发明具有高效、低成本、环境友好的优点，具有广阔的应用前景。
1.一种3-乙酰基呕吐毒素水解酶，其特征在于，所述酶的氨基酸序列包括：
2.一种3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因，其特征在于，所述3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因编码如权利要求1所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶。
3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体含有权利要求2所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶基因。
4.一种重组工程菌株，其特征在于，所述重组工程菌株含有权利要求3所述的重组表达载体。
5.一种融合酶，其特征在于，所述融合酶含有权利要求1所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶和呕吐毒素脱毒酶。
6.根据权利要求5所述的融合酶，其特征在于，所述呕吐毒素脱毒酶包括呕吐毒素脱氢酶；
7.根据权利要求1所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶或权利要求5所述的融合酶在水解3-乙酰基呕吐毒素中的应用；
8.一种降解3-乙酰基呕吐毒素的方法，其特征在于，所述方法包括：
9.根据权利要求8所述的降解3-乙酰基呕吐毒素的方法，其特征在于，所述反应温度为15～30℃，ph为7～8.5；
10.权利要求1所述的3-乙酰基呕吐毒素水解酶或权利要求5所述的融合酶在制备降解3-乙酰基呕吐毒素的产品中的应用。
