本发明涉及骨髓组织标本制备，尤其涉及一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法及其应用。
背景技术：
1、骨髓活检切片免疫组织化学染色检查是研究骨髓免疫微环境的重要方法，分析前骨髓活检组织标本需要经过固定→脱钙→脱水→包埋→切片→烤片→染色→封片几个步骤来处理，处理过程需要专业且贵重的设备，以及专门有有害气体配套处理设施的房间来进行操作。骨髓组织呈固体状，大小不一，一般是1～1.5厘米长，0.2厘米直径的圆柱体条形状物。骨髓组织标本属于小病理组织，标本可利用资源有限，预处理标本时需要经过专业的培训及反复的训练才能成功地制作出质量良好的骨髓切片。临床实践中，骨髓活检组织有存在短小，离断，碎裂，挤压，渗血凝固等取材质量不佳的情况，使后期制作的骨髓切片质量无法保障，从而影响到研究结果。
2、骨髓切片免疫组织化学染色是判断其细胞表面免疫表达的重要检查，因为本身的技术局限性，一张组化切片只能反映一个cd分子标志物结果，对有双表达，多表达cd分子的细胞可能会影响结果的准确性。骨髓活检组织检查反映的是二维平面切片上细胞的生物性质特征，当骨髓微环境中免疫成分细胞本身处于低水平时，为了能让所有行组织化学染色的切片均能覆盖该靶细胞，切片制备时需要更加严格，以保障所有行组化切片中靶细胞分布的方位一致性，否则可能会因部分切片丢失靶细胞而无法判断其分子表达结果。此外，骨髓活检切片除了具有制作过程繁琐，要求较高等缺点外，分析周期也长，一般需要7天左右才能完成其分析，且由于技术要求和成本效益等各种因素制约，国内只有少部分大医院开展了此项目，大部分送第三方检验公司进行检测，在送检流程及信息交流上也存在了一定的不便。
3、流式细胞术是一种在功能水平上对单细胞或其他生物粒子进行定量分析和分选的检测手段，具有速度快、精度高、准确性好等优点，成为当代最先进的细胞定量分析技术。流式细胞术能够快速测定单个细胞或细胞器的生物学性质，并把特定的细胞或细胞器从群体中加以分类收集。流式细胞术可以高速分析上万个细胞，并能同时从一个细胞中测得多个参数。结合相关cd分子标志物检测，能快速、准确地反映各分析细胞的免疫表达特征。
4、研究骨髓免疫微环境是造血细胞与非造血细胞之间在疾病发生、发展过程中相互关系之间的重要手段，是研究恶性血液病发生与发展机制的重要方法。例如在多发性骨髓瘤中，复杂的骨髓瘤微环境中的细胞和非细胞组分对骨髓瘤细胞的生长与存活起到独特的维持作用，特别是骨髓微环境中的免疫细胞(包括t细胞、自然杀伤细胞、单核-巨噬细胞、树突状细胞、髓源抑制细胞等)，不仅失去对恶性转化的骨髓瘤细胞的免疫监督和免疫杀伤作用，而且会在骨髓瘤细胞的影响下，发生功能失调，甚至促进和维系骨髓瘤生长和存活，诱导耐药的产生，导致疾病反复复发。
5、因为骨髓微环境本质上是研究骨髓组织原始结构中各种组成细胞的生物学性质特征，所以骨髓活检切片免疫组织化学染色检查是研究骨髓免疫微环境的重要手段。然而，骨髓病理切片检查本身有其技术局限性，存在骨髓细胞展开不充分，不能详细地观察细胞的结构特征，单张切片只能反映单个cd分子结果，靶细胞在部分切片中丢失等缺点，这些均可能影响结果的准确性。
6、现有文献报道的对骨髓组织解离是用组织镊夹住组织后，用手术刀在合适的培养基溶液中机械解离，再离心收集细胞。该方法过程缓慢，耗费时间长，且会出现培养基溢出现象，污染面较大，且骨髓组织深部细胞较难解离，解离的悬液会出现部分细胞团，骨髓细胞收集不充分，收集效率低。
7、流式细胞术虽然在判断细胞cd分子表达上更加准确，操作与分析也相对简单。但是需要样本处于单细胞悬液状态，骨髓组织活检样本不能直接应用于流式细胞术检测，因此，将骨髓组织活检样本解离成单细胞悬液是应用于流式细胞仪检测的前提。
技术实现思路
1、本发明的目的在于提供一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法。
2、为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
3、本发明提供了一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，包括如下步骤：
4、(1)取离体的骨髓组织，加入生理盐水，得到混合组织；
5、(2)当所述骨髓组织＞5mm时，使用装配有12～16g针头的注射器反复抽吸吹打所述混合组织至红色消失，得到骨髓组织初始悬液；当所述骨髓组织长度≤5mm，在得到骨髓组织初始悬液后还包括过滤，离心步骤；
6、(3)使用装配有23～27g针头的注射器抽吸吹打所述骨髓组织初始悬液2～4次，过滤，得到骨髓组织单细胞。
7、优选的，步骤(1)所述骨髓组织与生理盐水的质量体积比为1g：8～12ml。
8、优选的，步骤(2)和(3)所述注射器的规格为2～4ml。
9、优选的，步骤(2)和(3)所述针头为平口针头。
10、优选的，步骤(2)所述过滤时过滤网的规格为40～60目。
11、优选的，步骤(2)在反复抽吸吹打时，注射器针头应按骨髓组织从头至尾的顺序不时更换位点。
12、优选的，步骤(2)所述离心的离心力为1200～1800g，时间为4～6min。
13、优选的，步骤(3)所述过滤时过滤网的规格为250～350目。
14、本发明还提供了所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法制备得到的骨髓组织单细胞。
15、本发明还提供了所述的骨髓组织单细胞悬液在流式细胞检测中的应用。
16、与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
17、1、本发明提供的骨髓组织单细胞制备方法使骨髓组织中的骨髓细胞得到了充分而有效的分离(图2，图3)，骨髓微环境中各种细胞被分离成单细胞状态。
18、2、本方法为物理方法，细胞的化学特性未被破坏，不影响细胞的免疫表达，物理损伤不明显(图4，图5)，且本发明方法操作过程简捷方便。避免了骨髓组织免疫组化染色较为繁琐而严格的制作过程，单细胞悬液应用于流式细胞术检测，能从细胞立体面、多角度地进行分析，因而能更加准确、高效地反映骨髓免疫微环境状态。随着流式细胞仪在医院的广泛普及，转化应用于临床研究可行性高。
19、3、骨髓组织含有骨小梁，本发明先用14g(口径相对大点，内外直径分别为1.64和2.1毫米)的针头抽吸吹打，该型号针头外径与骨髓活检体的直径相似，目的是通过针头的反复冲洗使骨髓实质组织与骨小梁先剥离开，制备成初始悬液(此时的悬液中仍含小块的骨髓组织，需要继续解离)。然后用25g针头(口径相对小点，内外直径分别为0.26和0.52毫米)将初始悬液再制备成单个细胞悬液，使初始悬液中还未充分解离的小块骨髓组织通过其细小管道被捣碎而进一步解离成单细胞悬液。如果跳过14g针头的制备过程，直接使用25g针头，会出现在抽吸时负压形成作用下骨髓组织体部直接堵住针孔现象，过程会很不流畅，整个细胞悬液的制备过程也会非常慢。而如果一直用14g针头，因为其内径较大，初始悬液中的小块骨髓组织或细胞团会顺利地通过针管，无法将其捣碎制备为单细胞状态。因此，应该按两步法的策略逐步将其制备成单个细胞悬液。
20、4、现有方法对含骨髓组织碎块或者短小的样本是有技术约束的，因为样本小，无法将其制备成单细胞悬液，只能丢弃。本发明方法则可以对任何大小的骨髓组织进行单细胞悬液制备，可以对骨髓组织进行充分的细胞收集，提高收集率。
1.一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
2.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(1)所述骨髓组织与生理盐水的质量体积比为1g：8～12ml。
3.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)所述注射器的规格为2～4ml。
4.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)和(3)所述针头为平口针头。
5.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述过滤时过滤网的规格为40～60目。
6.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)在反复抽吸吹打时，注射器针头应按骨髓组织从头至尾的顺序不时更换位点。
7.根据权利要求1所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(2)所述离心的离心力为1200～1800g，时间为4～6min。
8.根据权利要求7所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法，其特征在于，步骤(3)所述过滤时过滤网的规格为250～350目。
9.权利要求1～8任一项所述的一种骨髓组织单细胞悬液的制备方法制备得到的骨髓组织单细胞。
10.权利要求9所述的骨髓组织单细胞悬液在流式细胞检测中的应用。
