一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化及保存方法与流程

1.本发明属于神经科学和细胞生物技术领域，具体涉及一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，还涉及了该神经干细胞的保存方法。


背景技术：

2.诱导多能干细胞（ipscs）衍生过程中的不确定性和低效性导致出现大量的诱导方法。ipscs的初始生成依赖于维持干细胞特性的关键转录因子的瞬时表达，目前已有许多诱导ipscs的方法，主要包括病毒方法和非病毒方法。从最早使用的逆转录病毒和慢病毒载体逐步发展到可诱导慢病毒载体、质粒、附加体、转座子，还有应用 mrna直接转染和蛋白添加，以及单独使用 microrna等，这些系统所获得的稳定的基因组整合有利于高而连续的因子表达和高效的ipscs诱导。虽然其中一些病毒诱导有助于细胞重编程的基础研究，但它与细胞移植治疗并不相容，因为存在重编程后反式基因被重新激活的风险。因此要实现临床的运用，非整合的方法更具有优势。
3.迄今为止，已经成功诱导出多种类型的体细胞来源的ipscs，例如角质细胞、皮肤成纤维细胞、外周血细胞、神经干细胞等等。但任何诱导方法都需要大量的起始细胞，目前遇到的最大问题之一是正常人或病人需要通过手术来获取供体细胞。尿液中存在一些从动物（包括人类）组织（主要是肾脏）中脱落的内皮细胞，这些尿液细胞是产生ipscs的一种细胞来源，其优点是不论任何年龄、种族、性别，都可以通过无创方法收集。此外，尿液细胞比皮肤成纤维细胞更容易诱导为多能状态，这可能是因为泌尿细胞不需要经历间充质到上皮的转化过程（met）。因此，尿液是ips细胞理想来源之一。
4.神经干细胞（nscs）可以从三种不同来源获得，包括直接从原代组织中提取、从体细胞转分化和从多能干细胞分化。从原代组织中提取由于来源有限，分离和低纯度的技术问题阻碍了基于nscs的细胞治疗的发展。此外，还有伦理和道德方面的问题。体细胞转分化是从一种类型的成熟体细胞转化为另一种类型的成熟体细胞，且没有经历中间的多能状态。时间较短，纯度高，同时也可以避免ipscs可能成瘤的安全性问题。从多能干细胞分化成nscs，有利于获得大量nscs，并促进了nscs的基础研究。因此，从多能干细胞分化是获得nscs的理想方法。
5.哺乳动物大量细胞系被广泛用于科学研究和药物发现，因此伴随着世界各地的细胞运输。目前细胞运输方法主要有：冻结运输和充液运输。冻结运输是一种利用特殊容器内盛液氮或干冰的运输方法。保存效果较好，但缺点是冻结和解冻操作的时间长，成本较高；在运输过程中，可能会遇到诸如细胞内冰晶形成、细胞质破裂甚至对细胞骨架或基因组结构产生影响的风险，此外干冰可能会引起爆炸，被定义为危险材料。世界上超过50％的国家禁止使用干冰运输，这也限制了通过这种方法在不同国家间转运细胞，并且常规使用的运输容器中的干冰最多只能持续1~2天。而充液运输是一种较为简单的运输方法，但容易发生培养液涌动，导致细胞剥落。为防止这一情况需把培养瓶灌满培养液，才能放心运输。这样
一来，成本也会增加，还存在细胞活性损失的风险。且仅适用于短距离和短时间（通常长达24小时）的细胞运输，并且许多类型的细胞无法在装有培养基的培养瓶中存活。为了解决上述细胞运输问题，研究人员开发了各种各样的方法，例如有研究报导应用一种基于matrigel在半固态凝胶条件下和环境温度下运输细胞的方法，另外也有研究发现将人脂肪干细胞封装在1.2％海藻酸钙中，可使其在4
°
c~23
°
c条件下存活72小时。但是上述方法都需要载体，技术操作复杂，效率差，成本高，不利于临床治疗。因此，寻找可以长时间保存、长距离运输，且成本低的新方法，迫在眉睫。


技术实现要素：

6.本发明的一个目的是提供一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，以解决现有的整合诱导方法临床安全性问题以及神经干细胞获取困难的问题，同时希望建立一个无饲养层、无血清、非整合的ipscs细胞库，存储大量的ipscs来源的nscs用来进行自体或者异体移植。
7.本发明的第二个目的是提供上述获得的nscs的一种保存方法，具有长时间保存、长距离运输，同时低成本、可直接用于神经干细胞移植的优势。
8.一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，包括以下步骤：步骤1：收集健康人尿液约200~300ml，分装到含2ml青霉素/链霉素双抗的50ml离心管中；400-800g，离心5-10min；收集沉淀，合并；加入5x青霉素/链霉素pbs约10~30ml，轻轻混匀；400-800 g，离心5-10min，倒掉上清，剩余0.2~1ml液体；步骤2：准备12孔培养板，0.1% gelatin包被30min以上，使用前弃去孔内液体；把步骤1剩余的液体加入到包被好的12孔培养板中，加入2ml regm培养基，再加入2ul primocin，置于37℃，5%co2培养箱内，静置培养，待细胞生长到90%以上的密度后按1:3的比例传代；步骤3：提前用matrigel包被培养板至少30min；选择p3代内生长状态好的尿液细胞，胰酶消化2~5min，加入培养基终止消化，100-200g，5-10min，离心；弃掉上清，用pbs重悬细胞，计数；取1x106细胞，100-200g，5-10min，离心，弃掉上清；根据试剂盒说明，加入basic nucleofector
tm solution for mammalian epithelial 82μl，supplement 18μl，重悬细胞；将质粒加入细胞悬液，混匀，电转；电转结束后，迅速加入少量regm培养基，将悬液加入提前包被好的培养板里，再加入pregm培养基适量，放入37℃，5%co2培养箱培养；观察细胞，待密度达到70%左右时，弃掉培养基，清洗两遍，加入mtesr1培养基；每日换液，待ips克隆出现，克隆长至直径1mm挑取克隆；步骤4：取步骤3诱导的多功能干细胞，铺板至六孔板中，加入10μm 27632，待细胞密度达到90%以上，铺matrigel包被12孔板过夜，细胞密度达到95%以上后，换n2b27+2i诱导培养基，每天换液，培养至细胞没有ipscs特性；dmem/f12洗一遍，加入n2b27维持培养基，刮取细胞块，接种到提前matrigel包被好的6孔板中，用维持培养基培养，每天换液；待出现花环样结构，在培养基中加入bfgf；两天后在去掉bfgf，继续培养2-3天，之后吸去培养基，加入dmem/f12清洗，刮取细胞块，用巴氏吸管转移到15ml离心管，静置10min，弃上清，加入dmem/f12洗一遍，100-200g，5-10min，离心；弃掉上清，加入n2b27培养基，转移到已提前包被好的6孔板，每天换液；继续培养2~4天，可见到明显的花环样结构，同时可以扩增神经干细胞；2~
solution for mammalian epithelial 82μl，supplement 18μl，重悬细胞；将质粒加入细胞悬液，混匀，电转；电转结束后，迅速加入少量regm培养基，将悬液加入提前包被好的培养板里，再加入pregm培养基适量，放入37℃，5%co2培养箱培养；观察细胞，待密度达到70%左右时，弃掉培养基，清洗两遍，加入mtesr1培养基，每日换液，待ips克隆出现，克隆长至直径1mm挑取克隆。
21.本发明在正常人的尿液细胞中诱导的多功能干细胞（uhipscs）简易的操作流程如图1所示。为验证此株细胞系具有多功能干细胞的特征以及其安全性，我们通过内源性多能基因表达（图2b，2c）、核型分析（图2d）、畸胎瘤形成（图2e）和str分析（图3）等常规方法进行了验证。
22.从图2a可以看出，尿液细胞培养至第6天，出现细胞克隆，培养至第13天，细胞密度达到95%以上，尿液细胞电转之后，出现ipsc细胞克隆，密度增大，边缘清晰，ipscs传代至p3代，细胞集落明显增多；从图2b可以看出，免疫荧光结果显示ipscs细胞内表达nanog因子；从图2c可以看出，尿液细胞（ucs）组不表达干细胞转录因子nanog、oct4、sox2，ipscs组表达特定的干细胞转录因子nanog、oct4、sox2，说明成功诱导多能干细胞；从图2d和图3可以看出，g显带染色体核型分析正常和str分析结果显示ipscs各个位点的重复与其来源的尿液细胞一致；从图2e可以看出，将ipscs细胞注射入裸鼠皮下，8周后观察到小鼠皮下注射部位有肿瘤产生，镜下观察到三个胚层结构，说明ipscs在体内具有向三个胚层的细胞多向分化潜能。
23.实施例2本实施例主要说明上述获得的人尿源性多功能干细胞向神经干细胞诱导的方法，具体包括以下步骤：取上述获得的诱导多功能干细胞，铺板至六孔板中，加入10μm 27632，待细胞密度达到90%以上，铺matrigel包被12孔板过夜；细胞密度达到95%以上后，换n2b27+2i诱导培养基，每天换液，培养至细胞没有ipscs特性；dmem/f12洗一遍，加入n2b27维持培养基，刮取细胞块，接种到提前matrigel包被好的6孔板中，用n2b27维持培养基培养，每天换液；待出现花环样结构，在培养基中加入bfgf（终浓度2μg/ml），两天后再去掉bfgf，继续培养2-3天，吸去培养基，加入dmem/f12清洗，刮取细胞块，用巴氏吸管转移到15ml离心管，静置10min，弃上清，加入dmem/f12洗一遍，160g，5min，离心，弃掉上清，加入n2b27培养基，转移到已提前包被好的6孔板，每天换液；继续培养2~4天，可见到明显的花环样结构，同时可以扩增神经干细胞，2~4天后，弃掉上清，加入accutase，放入培养箱5min，轻轻吹散，160g，5min，离心，收集的细胞可以冻存。
24.本实验通过ipscs获得需要的nscs（inscs），具备表达完整的干细胞功能特征、稳定的自我更新特性和供体细胞的可用性及安全性，图4证明了我们的inscs具有可用性及安全性。
25.图4a结果显示，ipscs至inscs每个阶段所需要的时间及培养基；图4b结果显示，ipscs至inscs分化过程；图4c结果显示，获得的inscs表达典型的神经干细胞marker pax6和nestin；图4d结果显示，获得的inscs，46条染色体，xy型，核型正常；图4e结果显示，获得的inscs未表达ipscs多能性基因oct4、nanog和sox2；图4f结果显示，获得的inscs不表达
neuron特异性 marker map2；图4g结果显示，获得的inscs不表达内胚层基因（gata4、afp）和中胚层基因（tbx1），但保留了早期神经外胚层基因sox1和pax6的高表达；实施例3本实施例公开了通过ipscs获得的nscs（inscs）的一种保存方法，具体包括以下步骤：把inscs消化为单细胞悬浮培养，4~6天后形成大小不一的neurospheres。收集这些neurospheres至15ml离心管，添加10ml培养基，并包上锡箔纸，室温保存。
26.在室温环境下放置7天neurospheres（图5a），实验结果显示，neurospheres仍然可以保持很好的形态，同时仍然具有像神经元分化的能力；在室温环境下放置9天，作为对照也将单层培养的inscs放在6孔板中，并包上锡箔纸，同样在室温环境放置9天。结果显示neurospheres存活率在80%以上，但是七天之后存活率开始下降，而单层细胞已经迅速萎缩凋亡（图5b）。
27.进一步为了测试neurospheres是否可以忍受不同的环境温度，我们将neurospheres分别储存在10
°
c、20
°
c和30
°
c，观察到在此三个温度环境下，细胞的存活率仍可达到80%以上（图5c）。同时我们将室温环境下7天的neurospheres和单层细胞的存活率与常规冷冻保存后复苏的inscs的存活率进行了比较，结果显示：单层存储的insc基本全部死亡，不能再进行下一步实验，而neurospheres仍可保持80%以上的存活率，和冷冻保存（90%以上）获得了相似的存活率（图5d）。 这表明在7天之内，对于inscs而言，neurospheres保存与冷冻保存效果一样好，并且对于inscs的远距离运输而言，球形保存比冷冻保存更方便和更经济。
28.藻酸钙包埋法可使脂肪来源的干细胞封装在藻酸钙在室温环境下存活三天。基质胶matrigel在半固态凝胶条件下和环境温度下运输细胞可保存其活力。与上面提到的保存细胞的方式相比，本方法不包含任何载体，只需要适量的培养基，且操作简单，仅需要常规的诱导方法到神经干单层细胞，再悬浮培养为神经球，室温环境下保存长达7天，其存活率超过80％。目前实验数据表明，神经干细胞可以直接以神经球悬浮在培养基中，并在环境温度下长距离运输。
29.本发明以上描述只是部分实施例，但是本发明并不局限于上述的具体实施方式。上述的具体实施方式是示意性的，并不是限制性的。凡是采用本发明的材料和方法，在不脱离本发明宗旨和权利要求所保护的范围情况下，所有具体拓展均属本发明的保护范围之内。

技术特征：
1.一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化及保存方法，其特征在于，包括如下步骤：步骤1：收集尿液来源的细胞并培养扩增，将培养扩增的尿液细胞重编程为诱导多功能干细胞ipscs；步骤2：收集诱导的ipscs，用诱导培养基诱导分化至细胞没有ipscs特性，加入维持培养基培养，出现花环样结构，培养基中加入bfgf，两天后在去掉bfgf，继续培养，收集细胞即为神经干细胞nscs；步骤3：神经干细胞nscs的保存。2.根据权利要求1所述一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，其特征在于，步骤1中，所述的ipscs的制备方法为：步骤1.1：取健康人尿液，加入双抗，离心，收集细胞；把收集的细胞加入到已被0.1% gelatin包被的12孔培养板中，加入regm培养基，培养传代；步骤1.2：收集p3代细胞，重悬细胞；将质粒加入细胞悬液，混匀，电转；加入提前用matrigel包被好的培养板里，再加入regm培养基培养，待密度达到70%左右时，收集细胞，加入无血清培养基进行培养重新编程；待ips克隆出现，挑取克隆。3.根据权利要求1所述一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，其特征在于，步骤1.2中质粒中含四种转录因子oct4、sox2、sv40t 和klf4的pcep4-mir302-367簇的附加型载体，电转条件为200v电压，电击300微秒，无血清培养基为mtesr1。4.根据权利要求1所述一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化方法，其特征在于，步骤2中，诱导培养基为n2b27+2i，dmem/f12培养基中1:1加入1%-5% n2和1%-5% b27，2i包含0.1-10μm dorsomorphin 和 5-20μm sb431542，维持培养基成分为去掉2i的n2b27，培养基加入bfgf的终浓度为2-5μg/ml。5.根据权利要求1所述一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的保存方法，其特征在于，步骤3中，将单层nscs消化为单细胞，加入无任何基质胶培养瓶中悬浮培养成球，加入n2b27培养基，包上锡箔纸室温储存。
技术总结
本发明公开了一种非整合无饲养层人尿源性诱导多能干细胞向神经干细胞的分化及保存方法，属于神经科学和细胞生物技术领域，选用收集尿液来源的细胞并培养扩增，诱导多能干细胞iPSCs诱导培养，诱导多能干细胞诱导分化神经干细胞NSCs并保存。本发明选用尿液作为iPSCs细胞来源，具有易获得、简单、低成本、非侵入性等优点，采用附加体episome诱导方法将iPSCs细胞诱导成NSCs，整个环节无动物源性细胞和其他成分，无饲养层且非整合无病毒感染，大大提高了iPSCs来源神经干细胞的可用性及安全性，为临床用于自体或异体移植提供了一种新的方法。同时将培养的NSCs以神经球的形式存储，可以在环境温度下保存一周的时间，为长时间保存、长距离运输提供了新的方法。长距离运输提供了新的方法。


技术研发人员：李志远 李帅 王利群 唐焱 邓思浩
受保护的技术使用者：长沙科雅生物科技有限公司
技术研发日：2020.12.22
技术公布日：2021/3/9