本发明涉及生物
技术领域：
，特别涉及一种脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法。
背景技术：
：脂肪组织是指由大量群集的脂肪细胞构成，在过去的很长时间，大家一直认为脂肪组织是单纯作为能量储存的器官。现有研究表明脂肪组织能影响胰岛素敏感性、血压水平、内皮功能、纤溶活动及炎症反应，参与多种重要病理生理过程，是一个极其重要的内分泌系统。近些年的研究发现越来越多的疾病与脂肪组织病变有关，比如脂肪组织肥大、肿瘤以及一些代谢性疾病。蛋白作为功能的承担着，脂肪细胞内与脂肪积累代谢的蛋白到底发生了怎样的变化也是研究者们关心和感兴趣的问题。然而由于脂肪组织的特殊性，其油脂成份含量很高一直是制约脂肪组织蛋白提取的一个难点。现有的脂肪组织样本蛋白提取方法大多用试剂盒提取亦或是提取步骤复杂，提取效果较差。脂肪组织蛋白提取的难点是脂肪组织中油脂含量很多，从而导致脂肪组织在蛋白提取过程中，要么提取不充分，得率较低；要么提取后的蛋白脂质以及其他杂质含量高；从而影响脂肪蛋白质组学的研究和发展。因此，如何开发一种提取得率高且杂质含量少的脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法，成为亟待解决的技术问题。技术实现要素：本发明目的是提供一种脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法，提取得率高且杂质含量少。为了实现上述目的，本发明提供了一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：混合液和复溶液；所述混合液包括体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈，所述复溶液包括8～9m尿素。进一步地，所述混合液包括体积比为3.2：1.8的乙醇和乙腈。进一步地，所述尿素的浓度为8m。进一步地，所述混合液还包括终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂。进一步地，所述复溶液还包括终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂。本发明还提供了一种脂肪组织蛋白提取方法，所述方法包括：获得样本粉末；向所述样本粉末中加入所述混合液，混匀静置，后于冰上进行第一超声，固液分离，获得固体；向所述固体中加入所述复溶液于冰上进行第二超声，离心后液体分成上层、中层、下层，取所述中层液体，离心后，获得上清，即为提取的蛋白。进一步地，所述获得样本粉末，包括：将脂肪组织样本研磨，获得样本粉末。进一步地，所述静置的条件为：于18～22℃下放置8～15min。进一步地，所述第一超声和所送第二超声的条件均为：超声波频率为20khz～80khz，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为2～4s，单次间隔时间为4～6s，超声总时间为4min～7min。进一步地，所述离心的转速为11000～13000g。本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：本发明提供的一种脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法，脂肪组织是由脂肪细胞组成，本发明的方法采用超声破碎，能够促进脂肪细胞及细胞器膜破碎，释放细胞质成分，而油、脂能够溶于体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈的混合液能够有效的溶解油脂成分，且所述混合体系能有效沉淀脂肪细胞破碎后释放的蛋白成份，防止脂肪油脂与蛋白形成油包水结构，离心后不溶于有机试剂的蛋白和细胞膜碎片等被沉淀，溶于有机试剂的脂质、色素被去除，最后加入尿素复溶沉淀变性的蛋白、提取细胞膜蛋白，从而使得提取得率高且杂质含量少。附图说明为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。图1为本发明实施例1提供的一种脂肪组织蛋白提取方法的流程图；图2为本发明实施例1-3中提取的蛋白的sds-page图；图3为有机试剂的混合比例与脂肪组织蛋白提取的得率之间的关系图；图4为采用实施例1的方法对花生成熟的种子提取获得的蛋白的sds-page图。具体实施方式下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。本申请实施例的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：根据本发明一种典型的实施方式，提供一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：混合液和复溶液；所述混合液包括体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈，所述复溶液包括8～9m尿素。本发明人分析了脂肪组织的结构成分和调研了现有的各类脂肪组织样本蛋白提取的方法。在保证脂肪蛋白提取得率和质量的前提下，兼顾安全环保和适用范围，开发了本发明的方法，简称uean法，该技术方法的详细原理是：脂肪组织是由脂肪细胞组成，超声破碎，能够促进脂肪细胞及细胞器膜破碎，释放细胞质成分，而油、脂能够溶于有机试剂，体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈能够有效的溶解油脂成分，且所述混合液能有效沉淀脂肪细胞破碎后释放的蛋白成份，防止脂肪油脂与蛋白形成油包水结构，离心后不溶于有机试剂的蛋白和细胞膜碎片等被沉淀，溶于有机试剂的脂质、色素被去除，最后加入尿素复溶沉淀变性的蛋白、提取细胞膜蛋白。通过该技术方法，我们测试了植物油脂含量高的样本(花生)，依旧能够适用，由于该技术方法的成本低且实验技术方法简单，故而，也能被很好的运用于工生产。且相比于传统的脂肪组织蛋白提取方法，不论是在实验流程的简单化、实验成本的低廉化、蛋白提取的得率最大化以及提取质量、适用范围以及环境优化等方面，本发明的试剂盒和方法都有很大的改善和提高。所述混合液中，所述乙醇和乙腈的体积比若小于3.1：1.9，则会影响有机溶剂对脂肪组织的破坏和溶解性，使脂肪细胞破碎不充分，造成提取蛋白得率低的不利影响；若所述体积比大于3.3：1.7，则会影响有机试剂对蛋白的沉淀效果，使破碎脂肪细胞释放的蛋白不能完全的沉淀，从而导致蛋白丢失，提取造成蛋白得率低不利影响；该实施方式中，所述乙醇和所述乙腈均为分析纯级别。作为本发明的可选方式，可将试剂盒中一份的试剂做成多个小样，每个小样中的混合液均为体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈。作为优选的实施方式，所述混合液包括体积比为3.2：1.8的乙醇和乙腈；所述尿素的浓度为8m。该参数为最佳的实验条件。作为优选的实施方式，所述混合液还包括终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂。所述复溶液还包括终浓度为1％蛋白酶抑制剂。目的是防止提取的蛋白被降解。根据本发明另一种典型的实施方式，提供一种脂肪组织蛋白提取方法，如图1所示，所述方法包括：s1、获得样本粉末；s2、向所述样本粉末中加入所述混合液，混匀静置，后于冰上进行第一超声，固液分离，获得固体；s3、向所述固体中加入所述复溶液于冰上进行第二超声，离心后液体分成上层、中层、下层，取所述中层液体，离心后，获得上清，即为提取的蛋白。所述步骤s1中，所述获得样本粉末，具体包括：将脂肪组织样本研磨，获得样本粉末。所述步骤s2中，所述样本粉末与所述混合液的质量体积比范围为：(0.3～0.4)g：(1～1.5)ml，该范围内有利于重复破坏溶解脂肪，便于超声破碎脂肪细胞和释放沉淀胞质蛋白。所述静置的条件为：于18～22℃下放置8～15min。静置一段时间，油、脂能够溶于体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈的混合液能够有效的溶解油脂成分，且所述混合体系能有效沉淀脂肪细胞破碎后释放的蛋白成份，防止脂肪油脂与蛋白形成油包水结构。所述第一超声条件为：超声波频率为20khz～80khz，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为2～4s，单次间隔时间为4～6s，超声总时间为3min～7min。第一超声的目的是促进脂肪细胞及细胞器膜破碎，释放细胞质成分。所述步骤s3中，所述固体与所述复溶液的质量体积比为0.3～0.4g：(0.6～0.8)ml，该范围内有利于沉淀蛋白的复溶和脂肪细胞膜蛋白的溶解。所述二超声的条件为：超声波频率为20khz～80khz，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为2～4s，单次间隔时间为4～6s，超声总时间为3min～7min。所述第二超声的目的是辅助溶解沉淀的胞质蛋白和脂肪细胞膜蛋白。本发明实施例提供的脂肪组织的提取方法同样也能运用于植物样本。下面将结合实施例、对比例及实验数据对本申请的脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法的制备方法进行详细说明。实施例11、本发明实施例提供了一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：混合液：体积比为3.2：1.8的乙醇和乙腈、终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂复溶液：8m尿素，终浓度为1％蛋白酶抑制剂；2、本发明实施例还提供了一种脂肪组织蛋白提取方法，所述方法包括：步骤s1、获得样本粉末；具体为：样液氮研磨：称取适量的组织样本，研磨成粉末；选取猪肥肉作为样本，提取脂肪组织蛋白；步骤s2、向研磨后的粉末中加入1ml所述混合液，振荡混合均匀；室温混匀10min(室温20℃)；冰上超声(超声5min，超声3s，停5s)，12000g离心，弃上清，沉淀稍稍风干；步骤s3、向s2中所得沉淀加入所述沉淀4倍体积的所述复溶液，冰上超声裂解(超声5min，超声3s，停5s)；离心取中间层液体(上层是油脂层，下层为杂质，中间层是蛋白溶液)，12000g离心10min，取上清，重复1次，获得上清，即为提取的蛋白；采用bca蛋白定量法或者bradford法进行蛋白定量；根据蛋白浓度取20ug蛋白用于sds-page(每孔上样体积保持一致，不足部分用2％sds补齐，加入lodingbuffer，上样。实施例21、本发明实施例提供了一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：混合液：体积比为3.1：1.9的乙醇和乙腈、终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂复溶液：8.5m尿素，终浓度为1％蛋白酶抑制剂；2、本发明实施例还提供了一种脂肪组织蛋白提取方法，所述方法包括：步骤s1、获得样本粉末；具体为：样液氮研磨：称取适量的组织样本，研磨成粉末；选取猪肥肉作为样本，提取脂肪组织蛋白；步骤s2、向研磨后的粉末中加入1ml所述混合液，振荡混合均匀；室温混匀10min(室温20℃)；冰上超声(超声5min，超声3s，停5s)，12000g离心，弃上清，沉淀稍稍风干；步骤s3、向s2中所得沉淀加入所述沉淀4倍体积的所述复溶液，冰上超声裂解(超声5min，超声3s，停5s)；离心取中间层液体(上层是油脂层，下层为杂质，中间层是蛋白溶液)，12000g离心10min，取上清，重复1次，获得上清，即为提取的蛋白；采用bca蛋白定量法或者bradford法进行蛋白定量；根据蛋白浓度取20ug蛋白用于sds-page(每孔上样体积保持一致，不足部分用2％sds补齐，加入lodingbuffer，上样。实施例31、本发明实施例提供了一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，所述试剂盒包括：混合液：体积比为3.3：1.7的乙醇和乙腈、终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂复溶液：9m尿素，终浓度为1％蛋白酶抑制剂；2、本发明实施例还提供了一种脂肪组织蛋白提取方法，所述方法包括：步骤s1、获得样本粉末；具体为：样液氮研磨：称取适量的组织样本，研磨成粉末；选取猪肥肉作为样本，提取脂肪组织蛋白；步骤s2、向研磨后的粉末中加入1ml所述混合液，振荡混合均匀；室温混匀10min(室温20℃)；冰上超声(超声5min，超声3s，停5s)，12000g离心，弃上清，沉淀稍稍风干；步骤s3、向s2中所得沉淀加入所述沉淀4倍体积的所述复溶液，冰上超声裂解(超声5min，超声3s，停5s)；离心取中间层液体(上层是油脂层，下层为杂质，中间层是蛋白溶液)，12000g离心10min，取上清，重复1次，获得上清，即为提取的蛋白；采用bca蛋白定量法或者bradford法进行蛋白定量；根据蛋白浓度取20ug蛋白用于sds-page(每孔上样体积保持一致，不足部分用2％sds补齐，加入lodingbuffer，上样。对比例1该对比例中，乙醇和乙腈的体积比改为3：2.0，其余均同实施例1。对比例2该对比例中，乙醇和乙腈的体积比改为3.4：1.6，其余均同实施例1。对比例3该对比例中，乙醇和乙腈的体积比改为2：2.2，其余均同实施例1。对比例4该对比例中，乙醇和乙腈的体积比改为4：1.8，其余均同实施例1。对比例5该对比例中混合液不含乙醇，其余均同实施例1。对比例6该对比例中混合液不含乙腈，其余均同实施例1。试验例1各实施例和各对比例的提取的蛋白的得率如表1所示，表1组别提取得率实施例11.21％实施例21.08％实施例30.95％对比例10.68％对比例20.79％对比例30.18％对比例40.23％对比例50.24％对比例60.15％所述提取得率的计算方式：提取蛋白总质量：提取前组织样本质量×100％。此得率为白色脂肪组织样本蛋白得率，灰色脂肪组织和植物高油脂含量样本得率会有所提高。比较各实施例和各对比例的提取方法，选取猪肥肉作为样本，提取脂肪组织蛋白的得率，各实施例和对比例的蛋白进行了sds-page，取等体积蛋白溶液跑胶，结果如图2所示；由表1和图2的数据可知：对比例1中，乙醇和乙腈的体积比为3：2.0，小于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.68％，表明提取效率低下；对比例2中，乙醇和乙腈的体积比为3.4：1.6，大于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.79％，表明提取效率低下；对比例3中，乙醇和乙腈的体积比为2：2.2，小于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.18％，表明提取效率低下；对比例4中，乙醇和乙腈的体积比为4：1.8，大于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.23％，表明提取效率低下；对比例5中，乙醇和乙腈的体积比为1：0，大于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.24％，表明提取效率低下；对比例6中，乙醇和乙腈的体积比为0：1，小于本发明(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的范围，提取得率只有0.15％，表明提取效率低下；综合上述实验，我们发现有机试剂的混合比例与脂肪组织蛋白提取的得率存在如图3所示关系，当乙醇和乙腈比列改变其蛋白得率也随之改变，并在乙醇：乙腈＝3.2：1.8处达到最大，达到最佳提取效果，与蛋白得率计算结果吻合。试验例2我们选择乙醇：乙腈＝3.2:1.8处按照实施例1的实验流程和方法，对植物油脂含量高的样本进行了测试，我们选取了花生成熟的种子，进行了蛋白提取，sds-page结果如图4所示。由图4可知，上述技术方法同样适用于提取植物油脂含量较高样本的蛋白质。最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。当前第1页1 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技术特征：1.一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：混合液和复溶液；所述混合液包括体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈，所述复溶液包括8～9m尿素。
2.根据权利要求1所述的一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述混合液包括体积比为3.2：1.8的乙醇和乙腈。
3.根据权利要求1所述的一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述尿素的浓度为8m。
4.根据权利要求1所述的一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述混合液还包括终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂。
5.根据权利要求1所述的一种脂肪组织蛋白提取试剂盒，其特征在于，所述复溶液还包括终浓度为0.1％蛋白酶抑制剂。
6.一种采用权利要求1-5任一所述试剂盒的脂肪组织蛋白提取方法，其特征在于，所述方法包括：
获得样本粉末；
向所述样本粉末中加入所述混合液，混匀静置，后于冰上进行第一超声，固液分离，获得固体；
向所述固体中加入所述复溶液于冰上进行第二超声，离心后液体分成上层、中层、下层，取所述中层液体，离心后，获得上清，即为提取的蛋白。
7.根据权利要求6所述的一种脂肪组织蛋白提取方法，其特征在于，所述获得样本粉末，包括：将脂肪组织样本研磨，获得样本粉末。
8.根据权利要求6所述的一种脂肪组织蛋白提取方法，其特征在于，所述静置的条件为：于18～22℃下放置8～15min。
9.根据权利要求6所述的一种脂肪组织蛋白提取方法，其特征在于，所述第一超声和所送第二超声的条件均为：超声波频率为20khz～80khz，采用多次超声方式，且相邻两次超声之间存在间隔时间，其中，单次超声时间为2～4s，单次间隔时间为4～6s，超声总时间为4min～7min。
10.根据权利要求6所述的一种脂肪组织蛋白提取方法，其特征在于，所述离心的转速为11000～13000g。
技术总结本发明公开了一种脂肪组织蛋白提取试剂盒和提取方法，所述试剂盒包括：混合液和复溶液；所述混合液包括体积比为(3.1～3.3)：(1.9～1.7)的乙醇和乙腈，所述复溶液包括8～9M尿素。所述提取方法包括：获得样本粉末；向所述样本粉末中加入所述混合液，混匀静置，后于冰上进行第一超声，固液分离，获得固体；向所述固体中加入所述复溶液于冰上进行第二超声，离心后液体分成上层、中层、下层，取所述中层液体，离心后，获得上清，即为提取的蛋白。本发明的方法提取的蛋白提取得率高且杂质含量少。
技术研发人员：陈亚运;赵海义
受保护的技术使用者：武汉金开瑞生物工程有限公司
技术研发日：2020.11.02
技术公布日：2021.03.12
