本发明属于细胞培养领域，特别涉及微载体培养细胞的计数方法。
背景技术：
微载体培养是目前公认的一种动物细胞大规模培养技术，其兼具悬浮培养和贴壁培养的优点，容易放大，广泛用于培养各种类型细胞。为了解细胞的增殖情况，需要统计细胞数量。基于可溶解的微载体进行计数，需加入酶类等物质溶解微载体，然后将微载体和细胞分离后取细胞悬液进行计数。而对于酶不可溶解微载体，细胞在微载体上生长密集，不易脱落下来，使用二维(2d)平面培养方法中的传统酶消化方式，需要离心、磷酸缓冲盐溶液(pbs)重悬、离心、胰蛋白酶消化细胞、离心、以及台盼蓝或者结晶紫染色等多个步骤以实现微载体上生长细胞的计数，整个过程需大约40分钟，不仅耗时耗力，而且细胞释放不完全，很容易仍然贴在微载体上，消化下来的细胞容易结团成片，使计数得到的细胞数量与实际细胞数量有较大差别。
而且，现有酶不可溶解微载体培养细胞计数方法，大多数采用荧光类染色测吸光率染色计数，这种技术方法往往需要专业的设备，且实验过程中需要提供标准曲线等指标作为参照，以及验证方法的准确性，这使得计数方法较为复杂。因此，人们亟需一种操作简单、计数准确的不可溶解微载体细胞培养后细胞的分离计数方法。
技术实现要素：
本发明的目的是提供一种微载体培养细胞计数方法，包括：取样离心：取适量微载体培养细胞混悬液，离心后去上清获得沉淀物；释放重悬：所述沉淀物加适量溶解剂，和洗涤剂混液重悬后静置；染色计数：加染色剂染色后混匀计数。
在一些实施例中，所述溶解剂为酸性试剂或碱性试剂，其中酸性试剂选自柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐、磷酸盐、马来酸盐、甘氨酸、苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙酸、氯化氢、甲酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸的生物缓冲剂中的至少一种。用酸性试剂尤其是柠檬酸，可以溶解酸可溶解微载体，并且可以显著地除去附着在细胞核膜上的细胞质成分，将微载体上的细胞更好洗脱，细胞核得到释放。同时由于酸性试剂降低了溶液的ph值，可以减少细胞核的破碎，保护细胞核的完整性，从而达到完整分离细胞核的目的。碱性试剂选自碳酸氢钠、三乙胺等胺类、吡啶、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钙和氨等生物缓冲剂中的至少一种。
在一些实施例中，所述洗涤剂选自tritonx-15，tritonx-100，tritonx-114，tritonn-57，tritonn-101，tritonqs-15，igepalca630，np-40和brij96中的至少一种。洗涤剂主要为非离子型表面活性剂，能够溶解脂质，增加细胞膜的通透性，便于后续的染色操作；洗涤剂与溶解剂混合后，能够使微载体上的贴壁细胞得到充分释放，而溶解剂的存在又起到保护细胞核的作用，避免细胞在洗涤剂中吹打时间过长而全部溶解。
在一些实施例中，所述微载体与细胞培养的时间为1-10天，优选3-6天。
在一些实施例中，所述离心速度为500-5000rpm，优选1000-2000rpm。
在一些实施例中，所述酸性试剂调节沉淀物重悬液ph值至1.5-4.5，优选2.0-3.0；浓度为0.01m-1m，优选0.1m-0.5m；所述洗涤剂浓度为0.05-5％(w/v)，优选0.1-2％(w/v)。若酸性剂ph过低，将重悬液ph降至1.5以下，细胞核可能被破坏；如果ph太高，细胞之间可能会相互粘附，使细胞不能良好地分散，影响细胞核的释放。
在一些实施例中，沉淀物重悬后静置1-30min，优选为4-7min，更优选为5min。
在一些实施例中，所述染色剂为结晶紫-柠檬酸染色液、台盼蓝染色液、龙胆紫溶液、健那绿溶液、甲基绿、吡罗红、醋酸洋红、苏木精等染色液中的至少一种。
在一些实施例中，所述结晶紫染色液浓度为0.01mg-1mg/ml，优选为0.1mg/ml；染色时间为1-10分钟，优选为3分钟。
在一些实施例中，所述计数方法为血细胞计数法，台盼蓝细胞仪计数法，和流式细胞仪计数法中的至少一种。
本发明的有益效果在于：酶不可溶解微载体在溶解剂环境下快速溶解，细胞和微载体快速分离释放，且细胞核得到较好保护；加入适当洗涤剂反复清洗加速细胞和载体分离速度，提高分离效果，且能增加细胞膜的通透性，便于后续的染色操作。整个过程条件温和、成本低廉、简单便捷。本发明计数方法简单易行，计数时间短，计数准确。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
定义：
微载体：在本发明中主要包括壳聚糖、n-三甲基壳聚糖等壳聚糖衍生物、几丁质、甲壳素、明胶、明胶衍生物、胶原、纤维蛋白、纤维蛋白原、纤维素、多聚赖氨酸、胞外基质蛋白、藻酸盐、糖胺聚糖、脱细胞软骨基质材料、丝素蛋白、琼脂糖、羟基磷灰石、聚己内酯、聚乳酸、聚乙烯醇、聚氧化烯聚丙烯共聚物、聚羟基乙酸、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、硫酸软骨素、透明质酸、透明质酸钠、聚左旋乳酸、聚乙醇酸、聚三亚甲基碳酸酯及共聚物、聚对二氧环己酮、葡聚糖和胸腺嘧啶等。
细胞：本发明主要包括293细胞、hek293细胞、hek-293t细胞、293t细胞、293tn细胞、293ft细胞、aav-293细胞、huvec细胞、ecv-304细胞、l929细胞、wb-f344细胞、l-02细胞、thp-1细胞、d407细胞、vero细胞、cho细胞、间充质干细胞、胚胎干细胞、脂肪干细胞或ips细胞等。
tritonx-15：辛苯昔醇，非离子型表面活性剂。
tritonx-100：聚乙二醇辛基苯基醚，非离子型表面活性剂。
tritonx-114：聚氧乙烯辛烷基苯酚醚，非离子型表面活性剂。
tritonn-57：辛基苯氧基聚乙氧基乙基磷酸酯，非离子型表面活性剂。
tritonn-101：聚乙二醇壬基苯基醚，非离子型表面活性剂。
tritonqs-15：聚醚硫酸盐表面活性剂。casno.11105-10-5。
igepalca630：非离子型表面活性剂，casno.9081-83-8。
np-40：乙基苯基聚乙二醇，非离子型表面活性剂。
brij96：聚氧乙烯(10)油基醚，非离子型表面活性剂。
本发明涉及的化学试剂均为现有产品，均可在市场上购得。
附图说明
图1为实施例1中壳聚糖明胶微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸溶液中的外观图片。
图2为实施例1中壳聚糖明胶微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸溶液中的显微镜图片。
图3为实施例2中壳聚糖明胶微球在不同浓度(0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％)的trition-100中的显微镜图片。
图4为实施例3中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸溶液中的外观图片。
图5为实施例3中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸溶液中的显微镜图片。
图6为实施例4中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同浓度(0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％)的tritonx-100溶液中的拍照图片。
图7为实施例5中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸-tritonx-100中的外观图片。
图8为实施例5中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同ph(2.02，3.5)的柠檬酸-tritonx-100中经结晶紫染色后的血细胞计数板计数显微镜图片。
图9为实施例6中壳聚糖明胶微球经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在柠檬酸tritonx-100中的外观图片，和壳聚糖明胶微球经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在柠檬酸np40中的外观图片。
图10为实施例6中壳聚糖明胶微球，经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在柠檬酸-tritonx-100体系和柠檬酸-np40体系中经结晶紫染色后的血细胞计数板计数显微镜图片。
具体实施方式
下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1壳聚糖明胶微球的柠檬酸溶解
将0.96g柠檬酸(上海沃凯)加入到10ml的去离子水中，得到0.5m的ph为1.67的柠檬酸溶液。将柠檬酸溶液各取1ml用去离子水按照一定的比例稀释，得到ph分别为2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。
将0.01g壳聚糖明胶微球经乙醇洗涤0.5h后，置于1ml的水溶液中再洗涤0.5h，1000rpm离心3min后去上清；然后加入500ul的ph分别为1.67，2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸溶液，吹匀后静置5min；显微镜下观察。
图1和图2分别显示了壳聚糖明胶微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)的柠檬酸溶液的外观图片和混匀后随机取样显微镜图片。图1中ph为1.67和2.02时溶液较为清澈，但在ph为3.5、4.3和5.31时，变浑浊。图2中ph为1.67中仅见1个微球，ph为3.5、4.3和5.31时微球数量明显增多，而ph为2.02时未观察到有微球。
因此，在ph为2.02的时候，壳聚糖明胶微球全部溶解；当ph降低到1.67时，壳聚糖明胶微球溶解了极大部分；随着ph从2.02增加到5.31，壳聚糖明胶微球越来越不溶解；说明壳聚糖明胶微球在2.02的时候是计数的最佳ph。
实施例2壳聚糖明胶微球的tritonx-100溶解
将0.5，1，3，5，10，20ul的tritonx-100加入到1ml的水溶液中，得到浓度分别为0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％的tritonx-100溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。
将0.01g壳聚糖明胶微球经乙醇洗涤0.5h后，置于1ml的水溶液中再洗涤0.5h，1000rpm离心3min后去上清；然后加入500ul的浓度分别为0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％的tritonx-100溶液，吹匀后静置5min；并通过显微镜观察。
图3显示壳聚糖明胶微球在不同浓度(0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％)的trition-100中的显微镜图片。可见，随着tritonx-100浓度从0.05％增加到2％，壳聚糖明胶微球不会发生溶解，因此tritonx-100的作用不是为了分解微载体材料。
实施例3:脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶微球柠檬酸溶解
将0.96g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.5m的ph为1.67的柠檬酸溶液。将柠檬酸溶液各取1ml用去离子水按照一定的比例稀释，得到ph分别为2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经乙醇洗涤0.5h后，置于1ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养10天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后分别加入500ul的ph为1.67，2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸溶液，吹匀后静置5min；取样后通过显微镜观察。
图4和图5分别显示脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶微球在不同ph(1.67，2.02，3.5，4.3，5.3)柠檬酸溶液中的外观拍照和取样显微镜图片。可见，与图1、图2对比，细胞培养后会使细胞布满在微载体周围，当培养时间过长时，细胞会将球与球团在一起，形成大块，这加深了细胞计数的难度。酸无法渗透到微载体上，因此会延长将微载体完全溶解的时间。但随着ph值的下降，混悬液不断变清澈，显微镜观察的取样溶液中细胞结团现象逐渐减少，微载体不断溶解，消化下来的细胞呈现递增的趋势，说明低ph的柠檬酸溶液还可以将微载体上成团的细胞更好的洗脱。
实施例4脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶微球tritonx-100溶解
将0.5，1，3，5，10，20ul的tritonx-100加入到1ml的水溶液当中，得到浓度分别为0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％的tritonx-100溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养10天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入500ul的浓度分别为0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％的tritonx-100溶液，吹匀后静置5min；并观察。
图6显示为实施例4中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同浓度(0.05，0.1，0.3，0.5，1，2％)的tritonx-100溶液中的拍照图片。不同浓度下外观图片并没有发生太大的改变。说明tritonx-100单独对细胞的消化作用有限。
实施例5柠檬酸和tritonx-100混合液对细胞培养后微球的溶解和计数
将0.96g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.5m的ph为1.67的柠檬酸溶液。将柠檬酸溶液各取1ml按照一定的比例稀释，得到ph分别为2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸溶液。然后将5ul的tritonx-100分别加入ph为1.67，2.02，3.5，4.3，5.31的1ml柠檬酸溶液中，得到不同ph的柠檬酸-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养10天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul的ph分别为1.67，2.02，3.5，4.3，5.31的柠檬酸-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。
图7，图8显示实施例5中经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在不同ph下的柠檬酸-tritonx-100中外观图片以及取样显微镜图片。可见，在柠檬酸和tritonx-100的共同作用下，细胞消化以及微球溶解方式是最快的。其中，ph为2.02的柠檬酸以及0.5％浓度的tritonx-100是相对好的进行微球计数的方式。
图中显示柠檬酸可以显著的溶解壳聚糖明胶微球，又能除去附着在细胞核膜上的细胞质成分，将微载体上的细胞更好洗脱，细胞核得到释放。同时由于溶解剂降低了溶液的ph值，可以减少细胞核的破碎，保护细胞核的完整性，从而达到完整分离细胞核的目的。
而tritonx-100为非离子型表面活性剂，能够溶解脂质，增加细胞膜的通透性，便于后续的结晶紫染色；洗涤剂与溶解剂混合后，能够使微载体上的贴壁细胞得到充分释放，而溶解剂可以保护细胞核细胞在洗涤剂中吹打时间过长而全部溶解。溶解剂与洗涤剂相互作用，使得达到快速进行微载体可溶解的细胞计数方法。
实施例6柠檬酸-tritonx-100体系和柠檬酸-np-40体系对细胞培养后微球的溶解和计数
分别取脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶微球和1ml培养10天的脂肪干细胞的壳聚糖明胶微球混悬液，1000rpm离心3min后去上清，然后分别加入500ul的柠檬酸(ph2.02)-tritonx-100(0.5％)溶液；
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
分别取脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶微球和1ml培养10天的脂肪干细胞的壳聚糖明胶微球混悬液，1000rpm离心3min后去上清；然后分别加入500ul的柠檬酸(0.1m)-np-40(0.5％)；
将以上4种溶液吹匀后静置5min；再加入500ul结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。
图9，图10分别显示了经脂肪干细胞培养的壳聚糖明胶细胞微球在柠檬酸tritonx-100体系和柠檬酸-np40体系中的外观图片和血细胞计数图片。
可见，从图片看来，np-40也能起到很好的作用，溶解脂质，增加通透性，更快更好的洗脱细胞。但仍能够看到一些微球残渣。
实施例7
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液。然后将5ul的tritonx-1加入该1ml柠檬酸溶液中，得到柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖明胶微球37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养10天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为4.1*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例8
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液。然后将5ul的tritonx-100加入该1ml柠檬酸溶液中，得到柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.25g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.2g壳聚糖明胶微球37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养5天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul0.5mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为3.6*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例9
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液。然后将10ul的tritonx-100该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(1％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-20℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.05g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养6天，取1ml混悬液在1300rpm离心5min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(1％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为2*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例10
将0.288g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.15m的柠檬酸溶液。然后将5ul的tritonx-100该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.15m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.5g人纤维蛋白溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾干燥设备中，用二流体喷雾装置喷入喷雾塔中，干燥得到壳聚糖明胶微球。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖人纤维蛋白微球在37℃，5％co2培养箱中经间充质干细胞(来源于人的脐带)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养6天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.15m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul0.5mg/ml结晶紫染色剂染色4min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为2.5*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例11
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液。然后将5ul的np40该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.1m)-np40(0.5％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80溶冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.15g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养6天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)-np40(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul0.5mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板计数。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为3.1*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例12
将0.06g冰醋酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的冰醋酸溶液。然后将5ul的tritonx-100加入该1ml柠檬酸溶液中，冰醋酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将1g明胶和1g纤维蛋白原加入50ml的水溶液中，将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-80℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到明胶纤维蛋白原微球。将0.15g明胶纤维蛋白原置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h即可。
将0.15g明胶纤维蛋白原微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养8天，取1ml混悬液1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul0.5mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul使用台盼蓝细胞仪计数进行观察。细胞核完整清晰。
实施例13
将0.084g碳酸氢钠加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的碳酸氢钠溶液。然后将5ul的tritonx-100该1ml碳酸氢钠溶液中，碳酸氢钠(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将1g壳聚糖和0.5g多聚赖氨酸加入50ml的去离子水中，再加入1ml的乙酸溶液在60℃下溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-60℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球。将壳聚糖微球经50ml乙醇洗涤0.5h，再浸泡在水中即可。
将0.15g壳聚糖多聚赖氨酸微球在37℃，5％co2培养箱中经293t细胞在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养8天，取1ml混悬液1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul碳酸氢钠(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血球计数板观察。细胞核完整清晰。
实施例14
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液，将其稀释成0.5m。然后将10ul的igepalca630加入该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.5m)-igepalca630(1％)溶液。
将0.25g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及1ml的乙酸溶液溶解。将溶液用二流体喷雾装置喷入喷雾干燥设备中，干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.2g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养5天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.5m)-igepalca630(1％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml吡罗红染色剂染色10min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板观察。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为4*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例15
将0.096g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.5m的柠檬酸溶液。然后将5ul的tritonx-100该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.5m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入1g壳聚糖及0.2ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-60℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.1g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经脂肪干细胞(来源于人的脂肪)在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养6天，取1ml混悬液在1000rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.5m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置5min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色3min后，吹打后取10ul滴入血细胞计数板观察。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为3.05*10^7个。细胞核完整清晰。
实施例16
将0.192g柠檬酸加入到10ml的去离子水中，得到0.1m的ph为2.02的柠檬酸溶液。然后将20ul的tritonx-100该1ml柠檬酸溶液中，柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液。
将0.5g明胶溶于50ml温度为60℃的热水中，加入0.5g壳聚糖及0.2ml的乙酸溶液溶解。将溶液置于喷雾冷冻设备中，用二流体喷雾装置喷入预冷至-40℃冷冻塔中，得到固化的冰球，冷冻干燥得到壳聚糖明胶微球(实验室自制，参照专利号202010075349.7和202011141932.x中制备方法制得壳聚糖明胶微球)。将壳聚糖明胶微球经50ml乙醇洗涤0.5h后，置于50ml的水溶液中再洗涤0.5h。
将0.03g壳聚糖明胶微球在37℃，5％co2培养箱中经293t细胞在50ml的培养基中(天津灏洋培养基)培养6天，取1ml混悬液在1300rpm离心3min后去上清；然后加入上述500ul柠檬酸(0.1m)-tritonx-100(0.5％)溶液，吹匀后静置10min；再加入500ul1mg/ml结晶紫染色剂染色10min后，吹打后取5ul滴入血细胞计数板观察。计数结果为50ml培养基中微球的总细胞数为1.95*10^7个。细胞核完整清晰。
将实施例7-16中的结果进行分析，可以看见清晰完整的细胞核，并且微球在这种方式下可以快速的溶解掉，使得细胞可以被消化下来。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
1.一种微载体培养细胞计数方法，其特征在于：包括：
取样离心：取适量微载体培养得到细胞混悬液，离心后去上清获得沉淀物；
释放重悬：所述沉淀物加适量溶解剂，和洗涤剂混液重悬后静置；
染色计数：加染色剂染色后混匀计数。
2.根据权利要求1所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述溶解剂为酸性试剂或碱性试剂，其中，酸性试剂选自柠檬酸、磷酸、柠檬酸盐、磷酸盐、马来酸盐、甘氨酸、苹果酸盐、琥珀酸盐、乳酸盐、甲酸盐、乙酸盐、丙酸盐、乙酸、氯化氢、甲酸、乳酸、苹果酸和抗坏血酸的生物缓冲剂中的至少一种；碱性试剂选自碳酸氢钠、三乙胺等胺类、吡啶、哌啶、氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钠、氢氧化钙和氨中的至少一种。
3.根据权利要求1-2所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述洗涤剂选自tritonx-15，tritonx-100，tritonx-114，tritonn-57，tritonn-101，tritonqs-15，igepalca630，np-40和brij96中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述微载体与细胞培养的时间为1-15天，优选3-6天。
5.根据权利要求4所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述离心速度为500-5000rpm，优选1000-2000rpm。
6.根据权利要求5的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述酸性试剂调节沉淀物重悬液ph值至1.5-4.5，优选2.0-3.0；浓度为0.01m-1m，优选0.1m-0.5m；所述洗涤剂浓度为0.05-5％(v/v)，优选0.1-2％(v/v)。
7.根据权利要求6所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：沉淀物重悬后静置1-30min，优选为4-7min，更优选为5min。
8.根据权利要求7所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述染色剂为结晶紫-柠檬酸染色液、台盼蓝染色液、龙胆紫溶液、健那绿溶液、甲基绿、吡罗红、醋酸洋红、苏木精等染色液中的至少一种。
9.根据权利要求8所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述结晶紫染色液浓度为0.01mg-10mg/ml，优选为1mg/ml；染色时间为1-10分钟，优选为3分钟。
10.据权利要求9所述的微载体培养细胞计数方法，其特征在于：所述计数方法为血细胞计数法，台盼蓝细胞仪计数法和流式细胞仪计数法中的至少一种。
技术总结