本发明涉及生物医药检测技术领域，尤其涉及一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒及其使用方法。
背景技术：
生物体的细胞内会产生多种抗氧化剂，例如谷胱甘肽，α-生育酚，抗坏血酸，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，过氧化物酶等，以防止活性氧ros潜在的有害作用。目前已经开发出多种测定法来测量特定抗氧化剂的浓度以及生物体细胞内存在的所有抗氧化剂的浓度。不同于其他间接检测法，还原铁抗氧化能力frap法能直接检测量样品中抗氧化剂对氧化作用抑制的能力。其原理是在低ph值下，样品中的抗氧化剂将fe3 -tptz络合物还原为fe2 -tptz，呈现蓝色。着色强度与样品中大多数非酶类抗氧化剂的还原能力成正比，因此可测量总体抗氧化能力。
frap法简单，快速，便宜且稳定，已广泛用于农业、营养以及生态研究的各个领域。在frap分析中，不需要样品预处理，化学计量因子恒定，线性范围宽，重现性极佳，灵敏度高。检测过程不需要高度专业的设备或技能，也不需要严格控制时间和反应条件。然而对于血液样本来说，采用frap法测量多个抗氧化剂并估算其精度通常需要的样本量太大，这使得研究人员难以对小型野生动物的抗氧化特征进行全面分析。
技术实现要素：
有鉴于此，本发明提出了一种准确性、稳定性好、灵敏度高的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒。
本发明的技术方案是这样实现的：本发明提供了一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，包括：试剂a、试剂b、试剂c、feso4·7h2o粉末、阳性对照tcep-hcl溶液和尿酸酶。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述试剂a包括醋酸溶液和醋酸钠溶液，试剂b包括tptz溶液和hcl溶液，试剂c包括fecl3溶液和tris-hcl溶液，上述溶液的溶剂为去离子水。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述醋酸溶液体积分数为1％-5％，醋酸钠溶液浓度为5-50mmol/l。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述tptz溶液浓度为5-50mmol/l，hcl溶液浓度为10-100mmol/l。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述fecl3溶液浓度为5-50mmol/l，tris-hcl溶液浓度为5-40mmol/l。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述阳性对照tcep-hcl溶液浓度是10-20mmol/l。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述尿酸酶浓度为1-5u/ml。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
s1，所述feso4·7h2o用去离子水溶解，配置浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50mmol/l的标准溶液；
s2，所述试剂a、试剂b、试剂c以体积比为10:1:1的比例混合，配成工作液；
s3，从96孔板中选取6个孔，将s1中配置的feso4·7h2o标准溶液分别加入这6个孔，每个孔加入量为20μl，作为标准曲线检测孔；另外选取1个孔加入20μl去离子水作为空白孔；再根据待测样品数量选取检测孔，并向孔内分别加入10μl待测样品和10ul尿素酶，作为样品检测孔；另选取1个孔，加入10μltcep-hcl和10ul尿素酶，作为阳性对照孔；分别向标准曲线检测孔、空白孔、样品检测孔、阳性对照孔中加入180μl工作液，混匀备用；
s4，37℃孵育3-5分钟后，于593nm处测定各孔吸光度，绘制标准曲线。
在以上技术方案的基础上，优选的，所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒在小型野生动物血清样本中的应用。
本发明的总抗氧化能力检测试剂盒相对于现有技术具有以下有益效果：
(1)通过加入尿酸酶，消除了血液样品中尿酸的干扰，结果更准确。
(2)优化了醋酸与醋酸钠的比例，使ph不受样品加入的影响，结果稳定重复性好。
(3)优化了各组分的浓度，使得在低浓度的样本测定上依旧能保持良好的线性关系，结果的准确性和稳定性更好，灵敏度更高，适合小型野生动物血清抗氧化特征进行全面分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为实施例一中兔血清抗氧化能力标准曲线图；
图2为实施例二中兔血清抗氧化能力标准曲线图；
图3为实施例三中兔血清抗氧化能力标准曲线图；
图4为对比例中兔血清抗氧化能力标准曲线图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施方式，对本发明实施方式中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施方式仅仅是本发明一部分实施方式，而不是全部的实施方式。基于本发明中的实施方式，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施方式，都属于本发明保护的范围。
以兔血清为试验材料，采用3个实施例和1个对照例检验试剂盒的准确性和稳定性。
实施例一
本实施例试剂盒，包括试剂a、试剂b、试剂c、feso4·7h2o粉末、阳性对照和尿酸酶。
试剂a：醋酸溶液、醋酸钠溶液，醋酸溶液体积分数为2.5％，醋酸钠溶液浓度为5mmol/l；
试剂b：tptz溶液和hcl溶液，tptz溶液浓度为15mmol/l，hcl溶液浓度为75mmol/l；
试剂c：fecl3溶液和tris-hcl溶液，fecl3溶液浓度为20mmol/l，tris-hcl溶液浓度为5mmol/l；
阳性对照：tcep-hcl溶液，浓度为10mmol/l；
尿酸酶：尿素酶浓度为1u/ml。
检测步骤：
s1，所述feso4·7h2o用去离子水溶解，配置浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.5mmol/l的标准溶液；
s2，所述试剂a、试剂b、试剂c以体积比为10:1:1的比例混合，配成工作液；
s3，从96孔板中选取6个孔，将s1中配置的feso4·7h2o标准溶液分别加入这6个孔，每个孔加入量为20μl，作为标准曲线检测孔；另外选取1个孔加入20μl去离子水作为空白孔；再根据待测样品数量选取检测孔，并向孔内分别加入10μl兔血清样品和10ul尿素酶，作为样品检测孔；另选取1个孔，加入10μltcep-hcl和10ul尿素酶，作为阳性对照孔；分别向标准曲线检测孔、空白孔、样品检测孔、阳性对照孔中加入180μl工作液，混匀备用；
s4，37℃孵育3-5分钟后，于593nm处测定各孔吸光度，绘制标准曲线。
实施例二
本实施例试剂盒，包括试剂a、试剂b、试剂c、feso4·7h2o粉末、阳性对照和尿酸酶。
试剂a：醋酸溶液、醋酸钠溶液，醋酸溶液体积分数为5％，醋酸钠溶液浓度为35mmol/l；
试剂b：tptz溶液和hcl溶液，tptz溶液浓度为50mmol/l，hcl溶液浓度为100mmol/l；
试剂c：fecl3溶液和tris-hcl溶液，fecl3溶液浓度为5mmol/l，tris-hcl溶液浓度为25mmol/l；
阳性对照：tcep-hcl溶液，浓度为15mmol/l；
尿酸酶：尿素酶浓度为5u/ml。
检测步骤同实施例一。
实施例三
本实施例试剂盒，包括试剂a、试剂b、试剂c、feso4·7h2o粉末、阳性对照和尿酸酶。
试剂a：醋酸溶液、醋酸钠溶液，醋酸溶液体积分数为1％，醋酸钠溶液浓度为50mmol/l；
试剂b：tptz溶液和hcl溶液，tptz溶液浓度为5mmol/l，hcl溶液浓度为10mmol/l；
试剂c：fecl3溶液和tris-hcl溶液，fecl3溶液浓度为50mmol/l，tris-hcl溶液浓度为40mmol/l；
阳性对照：tcep-hcl溶液，浓度为20mmol/l；
尿酸酶：尿素酶浓度为2.5u/ml。
检测步骤同实施例一。
对比例一
市场上的一种总抗氧化能力检测试剂盒(frap法)试剂盒，产品编号:s0116，包括tptz稀释液、tptz溶液、检测缓冲液、feso4·7h2o、trolox溶液。
检测步骤：
s1，所述feso4·7h2o用去离子水溶解，配置浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50mmol/l的标准溶液；
s2，按照tptz稀释液、tptz溶液、检测缓冲液体积比10:1:1配制工作液；
s3，从96孔板中选取6个孔，将s1中配置的feso4·7h2o标准溶液分别加入这6个孔，每个孔加入量为20μl，作为标准曲线检测孔；另外选取1个孔加入20μl去离子水作为空白孔；再根据待测样品数量选取检测孔，并向孔内分别加入20μl兔血清样品，作为样品检测孔；另选取1个孔，加入20μltrolox溶液，作为阳性对照孔；分别向标准曲线检测孔、空白孔、样品检测孔、阳性对照孔中加入180μl工作液，混匀备用；
s4，37℃孵育3-5分钟后，于593nm处测定各孔吸光度，绘制标准曲线。
相关性和准确性试验
将实施例1、2、3的试剂盒作为实验组，对比例为市场上获得认可的准确度优异的试剂盒作为对照组进行对比实验，检测的结果如图1-4。
通过图1-4的检测数据可知，3个实施例检测试剂盒与对比检测试剂盒的检测结果线性相关系数r分别为0.9965、0.9972、0.9974、0.9922；标准差s分别为0.0469、0.0465、0.0466、0.0677；实施例1-3相关性比较好，标准差比较低，且相互之间差异小，表明本发明试剂盒添加的尿酸酶不仅对准确性不会造成影响，而且试剂盒依的准确性更高。
稳定性试验
找到兔血清中氧化值高值样本为0.75mmol/l，用生理盐水进行系列稀释，配制5个不同浓度的样本，依次为0.15mmol/l、0.30mmol/l、0.45mmol/l、0.60mmol/l、0.75mmol/l、浓度的样本，每个浓度水平各样本分别测定3次，分别取其平均值。分别利用4个实施例的试剂盒进行检测。检测结果如表1所示：
表1实施例1-4稳定性验证结果
上述检测结果显示，4个实施例检测结果相关性均大于0.99，实施例1、2、3的检测结果大于0.999，与对比例(对照)相比具有更好的线性相关性，这说明本发明试剂具有更好的稳定性和灵敏度。同时也表明实施例1-3在低浓度的样本测定上能保持良好的线性关系，结果的准确性和稳定性更好，灵敏度更高。
以上所述仅为本发明的较佳实施方式而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于，包括：试剂a、试剂b、试剂c、feso4·7h2o粉末、阳性对照tcep-hcl溶液和尿酸酶；
所述试剂a包括醋酸溶液和醋酸钠溶液，试剂b包括tptz溶液和hcl溶液，试剂c包括fecl3溶液和tris-hcl溶液，上述溶液的溶剂为去离子水。
2.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于，所述醋酸溶液体积分数为1％-5％，醋酸钠溶液浓度为5-50mmol/l。
3.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于，所述tptz溶液浓度为5-50mmol/l，hcl溶液浓度为10-100mmol/l。
4.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于，所述fecl3溶液浓度为5-50mmol/l，tris-hcl溶液浓度为5-40mmol/l。
5.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于：所述阳性对照tcep-hcl溶液浓度为10-20mmol/l。
6.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒，其特征在于，所述尿酸酶浓度为1-5u/ml。
7.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒的使用方法，其特征在于，步骤如下：
s1，所述feso4·7h2o用去离子水溶解，配置浓度为0、0.25、0.50、0.75、1.00、1.50mmol/l的标准溶液；
s2，所述试剂a、试剂b、试剂c以体积比为10:1:1的比例混合，配成工作液；
s3，从96孔板中选取6个孔，将s1中配置的feso4·7h2o标准溶液分别加入这6个孔，每个孔加入量为20μl，作为标准曲线检测孔；另外选取1个孔加入20μl去离子水作为空白孔；再根据待测样品数量选取检测孔，并向孔内分别加入10μl待测样品和10ul尿素酶，作为样品检测孔；另选取1个孔，加入10μltcep-hcl和10ul尿素酶，作为阳性对照孔；分别向标准曲线检测孔、空白孔、样品检测孔、阳性对照孔中加入180μl工作液，混匀备用；
s4，37℃孵育3-5分钟后，于593nm处测定各孔吸光度，绘制标准曲线。
8.如权利要求1所述的一种高灵敏度总抗氧化能力检测试剂盒在小型野生动物血清样本中的应用。
技术总结