本发明属于分析检测技术领域，尤其涉及一种检测去乙酰化酶用纳米传感器及其检测方法和应用。
背景技术：
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
赖氨酸侧链的乙酰化是重要的翻译后修饰，在多种信号传导环境中影响蛋白质功能。赖氨酸的乙酰化状态受赖氨酸乙酰化酶和赖氨酸去乙酰化酶的调控。sirtuin1(sirt1)是一种重要的组蛋白去乙酰化酶，它可以利用烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad )代替锌作为辅因子来催化乙酰基从赖氨酸残基上去除。sirt1与许多生物学过程密切相关，其中包括应激反应、dna修复、代谢及凋亡、衰老。因此，sirt1活性的检测具有重要意义。
组蛋白去乙酰化酶的检测方法包括放射性标记法、高效液相色谱法、免疫印迹法、分光光度法、质谱法。传统的放射性测定法通过监测放射性标记的肽所释放的[3h]乙酸盐或放射性标记的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nad)所释放的[14c]烟酰胺来检测sirt1的活性。高相液相色谱法以液体为流动相，利用底物与产物之间不同的洗脱特性，从而在柱内将各种成分分离，进入检测器进行检测。免疫印迹法采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，经过page分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上，以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。分光光度法通过测定酶在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，进而对该酶进行定性和定量分析。质谱法通过在自组装单分子膜上形成的肽阵列与质谱的结合，从而提供了一种无标记的方法来鉴定酶活性的模式。
但是，发明人发现，这些方法存在产生放射性废物、需通过溶剂萃取和离子交换树脂分离反应产物、步骤操作繁琐以及复杂的标记底物等缺点。为了克服上述缺陷，通过结合编码荧光探针、分子内酯交换探针和聚集诱导发射型探针，利用发光分析法，用于sirt1活性测定。然而，这些方法需要通过肽/抗体的共价标记制备探针，操作繁琐。因此，非常需要设计一种简单的方法来准确，灵敏地检测sirt1活性。
技术实现要素：
为了解决现有技术的不足，本公开的目的是提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器及其检测方法和应用，该纳米传感器具有较高的特异性和灵敏度，并且，检测步骤简单，无需任何洗涤和分离步骤，无放射性污染物的产生。
具体地，本公开的技术方案如下所述：
在本公开的第一方面，提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器，所述纳米传感器包括带有赖氨酸乙酰基且有cy5标记的肽底物和被链霉亲和素包被的量子点，通过链霉亲和素-生物素化相互作用将所述肽连接到链霉亲和素修饰的量子点表面。
在本公开的第二方面，提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器的检测方法，具体检测方法如下：
(1)、将待检测样品加入至生物素化试剂，进行生物素化；
(2)、将步骤(1)获得的生物素化产物加入到含有量子点的缓冲溶液中孵育，获得检测去乙酰化酶用纳米传感器；
(3)、采用全内角反射荧光技术的单分子荧光成像系统对cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的去乙酰化酶。
在本公开的第三方面，提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器在检测去乙酰化酶活性和/或筛选去乙酰化酶抑制剂和/或检测细胞中的去乙酰化酶中的应用。
本公开中的一个或多个技术方案具有如下有益效果：
(1)、为了提高检测去乙酰化酶活性的灵敏度，将多个生物素化肽通过是生物素-链霉亲和素相互作用组装都单量子表面，从而诱导量子点与cy5之间的高效荧光共振能量转移(fret)，通过基于全内反射荧光的单分子检测可以对生成的cy5信号进行简单量化，这种基于单个量子点(qd)的纳米传感器可以灵敏地检测sirt1，检测限低至3.91pm，可用于sirtuin1(sirt1)抑制剂的筛选。
(2)、本公开的纳米传感器具有较高的特定性，当使用组蛋白去乙酰化酶hdac8作为干扰蛋白，既不会发生去乙酰化反应和生物素化反应，也不会发生基于qd的纳米传感器的构建，不能观察到cy5信号。相反，在对sirt1的响应中检测到显著的cy5计数。这些结果表明该纳米传感器对sirt1具有高度特异性。
(3)、本公开只需将cy5修饰的肽底物、sirt1、生物素化试剂、qd混合即可检测sirt1，检测方法具有简单、便捷、快速的优点，无需任何洗涤和分离步骤、特异性抗体以及编码的荧光探针的合成，且无放射性物质产生，相对于现有技术其他检测方法具有较高的优势。
附图说明
构成本公开的一部分的说明书附图用来提供对本公开的进一步理解，本公开的示意性实施例及其说明用于解释本公开，并不构成对本公开的不当限定。
以下，结合附图来详细说明本公开的实施方案，其中：
图1：基于量子点的纳米传感器检测去乙酰化酶的机理示意图；
图2：不存在sirt1和存在sirt1的情况下测量605qd和cy5荧光发射光谱，插图显示了从645到750nm的放大荧光光谱。
图3：不存在sirt1(a-c)和存在sirt1(d-f)的情况下的荧光图像，605qd通道和cy5通道中相同区域的荧光图像是在405nm的激发波长下同时获取的，比例尺为5μm。
图4：(a)在0m至3.6×10-7m浓度范围内，cy5计数随sirt1的浓度变化呈函数关系。在1.2×10-11m到6.0×10-9m范围内，cy5计数与sirt1的浓度的对数呈线性关系。(b)响应180nmsirt1、180nmhdac8和反应缓冲液而测得的cy5计数。
图5：ex-527对sirt1去乙酰酶活性的抑制曲线。
图6：(a)a549和hela细胞提取物中cy5的计数。(b)cy5计数与a549细胞数呈线性关系。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本公开。应理解，这些实施例仅用于说明本公开而不用于限制本公开的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。本发明所使用的试剂或原料均可通过常规途径购买获得，如无特殊说明，本发明所使用的试剂或原料均按照本领域常规方式使用或者按照产品说明书使用。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本公开的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作和/或它们的组合。
术语解释：
cy5：表示花菁5；
hepes：羟乙基哌嗪乙硫磺酸；
605qd：指的是最大发射波长为605nm的量子点。
正如背景技术所介绍的，目前用于检测去乙酰化酶的方法存在产生放射性废物、需通过溶剂萃取和离子交换树脂分离反应产物、步骤操作繁琐以及复杂的标记底物等缺点。为了克服这些缺陷，本公开提供了一种检测去乙酰化酶用纳米传感器及其检测方法和应用。
在本公开的一种或多种实施方式中，提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器，所述纳米传感器包括带有赖氨酸乙酰基且有cy5标记的肽底物和被链霉亲和素包被的量子点，通过链霉亲和素-生物素化相互作用将所述肽连接到链霉亲和素修饰的量子点表面。
多个生物素化肽可以通过生物素-链霉亲和素相互作用组装到qd表面，从而诱导了qd与cy5之间的高效荧光共振能量转移(fret)。通过基于全内反射荧光的单分子检测可以对生成的cy5信号进行简单量化，这种基于单个量子点(qd)的纳米传感器可以灵敏地检测sirt1。
进一步地，所述肽的赖氨酸被生物素化修饰，n末端cy5修饰。
进一步地，底物序列为cy5-glu-lle-ala-gln-asp-phe-lys(ac)-thr-asp-leu-arg。
进一步地，所述量子点为链霉亲和素包被的量子点(605qd)；所述605qd最大发射波长为605nm。
进一步地，所述生物素化试剂选自n-羟基磺酸基琥珀生物素(sulfo-nhs-biotin)、磺基琥珀酰亚胺-6-(生物素)己酸(sulfo-nhs-lc-biotin)或sulfo-nhs-ss-biotin。基于sulfo-nhs-biotin是一种水溶性的生物素化试剂，为了将生物素共价结合在伯胺上，优选的，所述生物素化试剂为n-羟基磺酸基琥珀生物素(sulfo-nhs-biotin)。
其中，具有一个赖氨酸乙酰基的肽既充当cy5荧光团载体，又可以作为检测sirt1的底物。在存在sirt1的情况下，它会除去乙酰化肽中的乙酰基，并且所得的去乙酰基肽可与sulfo-nhs-biotin反应形成生物素化肽。
在本公开的一种或多种实施方式中，提供上述任意一种纳米传感器检测去乙酰化酶的检测方法，具体检测方法如下：
(1)、将待检测样品加入至生物素化试剂，进行生物素化；
(2)、将步骤(1)获得的生物素化产物加入到含有量子点的孵育缓冲溶液中孵育，获得检测去乙酰化酶用纳米传感器；
(3)、采用全内角反射荧光技术的单分子荧光成像系统对步骤(2)中的纳米传感器的cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的去乙酰化酶。
在存在sirt1的情况下，sirt1会除去乙酰化肽中的乙酰基，并且所得的去乙酰基肽可与生物素化试剂反应形成生物素化肽，多个生物素化肽可以通过生物素-链霉亲和素相互作用组装到qd表面。
进一步地，步骤(1)中，所述待检测样品包括cy5标记的肽底物、sirt1、nad 和去乙酰化缓冲液。
进一步地，步骤(1)中，所述待检测样品的体积为10μl；所述cy5标记的肽底物的浓度为200-350μm，优选的，为300μm。
进一步地，步骤(1)中，所述nad 的浓度为0.5-2.0mm，优选的，为1mm。
进一步地，步骤(1)中，所述去乙酰化缓冲液的ph为8.0，包括20mmhepes，150mmnacl，2.7mmkcl，1mmmgcl2。
进一步地，步骤(1)中，所述待检测样品进行生物素化之前，需要在30-45℃下孵育1-3个小时，得到去乙酰化产物；优选的，需要在37℃下孵育1.5小时。
更进一步地，步骤(1)中，将所得到的去乙酰化产物用生物素化试剂和hepes至总体积为50μl，进行生物素化反应。
进一步地，步骤(1)中，所述生物素化试剂的浓度为100-150μm，所述hepes的ph为7.0-9.0，浓度为10-30mm，优选的ph为8.0，浓度为20mm。
进一步地，步骤(1)中，所述生物素化反应的温度为10-30℃，反应时间为1-4h；优选的，所述反应的温度为20℃，反应时间为3h。
进一步地，所述步骤(2)中，所述生物素化产物的体积为0.5-1.5μl；优选的，为0.9μl。
进一步地，所述步骤(2)中，量子点为605qd，所述605qd的浓度为8-23nm，优选的，为15nm。
进一步地，所述步骤(2)中，所述孵育缓冲溶液的体积为60μl，包括10mm(nh4)2so4，100mmtris-hcl，3mmmgcl2，ph8.0。
进一步地，所述孵育的条件是在室温下孵育10-30分钟，优选的，为20分钟。
进一步地，所述步骤(3)中，在成像之前，将步骤(2)中的纳米传感器在孵育缓冲液中稀释100-200倍，稀释后，将取5-15μl样品放在盖玻片上进行成像；优选的，以稀释150倍最佳。
在本公开的一种或多种实施方式中，提供一种检测去乙酰化酶用纳米传感器在检测去乙酰化酶活性和/或筛选去乙酰化酶抑制剂和/或检测细胞中的去乙酰化酶中的应用。
为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本公开的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本公开的技术方案。
实施例1
一种检测去乙酰化酶用纳米传感器的形成：去乙酰化酶的检测步骤：
首先，10μl去乙酰化溶液，其中包含300μmcy5标记的肽底物，不同浓度的sirt1、1mmnad 和去乙酰化缓冲液(20mmhepes，150mmnacl，2.7mmkcl，1mmmgcl2，ph8.0)在37℃下孵育1.5小时。其次，将去乙酰化产物用120μmsulfo-nhs-biotin和20mmhepes(ph8.0)至总体积为50μl，在20℃下反应3h进行生物素化。最后，将0.9μl生物素化产物和15nm605qd重悬到60μl孵育缓冲液(10mm(nh4)2so4，100mmtris-hcl，3mmmgcl2，ph8.0)中在室温下孵育20分钟获得605qd-肽-cy5纳米结构。
荧光检测：荧光光谱通过使用荧光光谱仪测得。激发狭缝设定为3.0nm，发射狭缝设定为0.5nm。在405nm的激发波长下，记录从550到750nm的发射光谱信号。使用605nm(605qds的最大发射波长)和670nm(cy5的最大发射波长)的荧光强度进行数据分析。
单分子测量和数据分析：通过使用全内反射荧光(tirf)显微镜获取单分子荧光图像。在成像之前，将反应产物在孵育缓冲液中稀释150倍。稀释后，将10μl样品放在盖玻片上进行成像。用405nm激光激发605qd。在双视图中，通过二向色镜和带通滤光片(605qd为573-613nm，cy5为661.5-690.5nm)分离了来自605qd和cy5的荧光信号。为了进行数据分析，使用imagej软件选择600×600像素区域用于cy5分子计数。通过10张图获得cy5分子的数目。
抑制剂实验：对于sirt1的抑制剂分析，将不同浓度的ex-527与含有300μmcy5标记的肽底物，180nmsirt1、1mmnad 和去乙酰化缓冲液的反应溶液混合，然后进行上述三步反应。
该方法的检测机理图(如图1)：本公开设计了一个带有赖氨酸乙酰基且有cy5修饰的肽作为底物，利用该肽底物检测sirt1。其中，该底物的序列为cy5-glu-lle-ala-gln-asp-phe-lys(ac)-thr-asp-leu-arg。该测定涉及sirt1介导的去乙酰化反应和生物素化反应，605qd-肽-cy5纳米结构的构建以及随后信号的测量。在sirt1存在的情况下，将乙酰化的肽底物与sirt1和nad 一起孵育，从而使乙酰基从赖氨酸ε-氮上选择性去除，并生成去乙酰基的赖氨酸。然后，脱乙酰基的赖氨酸可以与sulfo-nhs-biotin反应，从而生成生物素化的赖氨酸。生物素使具有cy5修饰的肽通过生物素-链霉亲和素相互作用在605qd表面快速自组装，形成605qd-肽-cy5纳米结构。在405nm的激发波长下，由于从605qd到cy5的具有高fret效率的特点，因此测量了cy5计数以定量sirt1活性。相反，在没有sirt1的情况下，去乙酰化反应或生物素化反应都不会发生，因此cy5修饰的肽底物保持完整。结果，无法将cy5修饰的肽底物组装到605qd表面上，并且未观察到cy5计数。因此，这种基于qd的纳米传感器可用于sirt1的灵敏检测。
实施例2
1.可行性实验
为了验证该测定的可行性，本公开使用荧光光谱验证了基于单个qd的纳米传感器的sirt1去乙酰化激活的结构(图2)。在没有sirt1的对照组中未检测到cy5信号，这表明从605qd到cy5没有发生fret。相反，sirt1的存在导致605qd荧光强度降低，同时cy5荧光强度增加，这表明由于605qd-肽-cy5纳米结构的形成，发生了从605qd到cy5的有效fret。
然后，采用了单分子成像技术来检测sirt1活性(图3)。在405nm的激发波长下，在没有sirt1的情况下，在受体通道中未观察到cy5荧光信号(图3b)。当存在sirt1时，将同时获取605qd(图3d)和cy5(图3e)的荧光图像。存在sirt1时的605qd强度(图3d)要比没有sirt1时的605qd强度(图3a)低得多。并且在基于单个qd的纳米传感器中，由于从605qd到cy5的fret，观察到表示605qd和cy5共定位的信号(图3f箭头指示)。这些结果清楚地表明，cy5计数的简单定量可用于准确测量sirt1活性。
2.灵敏度检测
为了研究所提出的基于单个qd的纳米传感器对sirt1的灵敏度，在最佳实验条件下测量了不同浓度的sirt1对应的cy5的计数。如图4a所示，随着sirt1浓度从0m到3.6×10-7m的增加，cy5计数单调增加。cy5计数与sirt1浓度的对数在1.2×10-11m到6.0×10-9m范围内呈线性相关。相关方程为n＝1776 148log10c(r2＝0.996)，其中n是cy5的计数，c是sirt1的浓度(m)。计算得出的检出限为3.91×10-12m。值得注意的是，本方案提出的方法与基于分子内fret的检测方法(4.76nm)相比，灵敏度提高了1217倍，与基于g-四链体的荧光检测方法(1nm)相比提高了256倍，与发光分析(0.5nm)相比，提高了128倍。灵敏度的提高可能归因于特异性sirt1介导的去乙酰化反应，特异性生物素-链霉亲和素的相互作用以及单分子检测的高灵敏度。
3.特异性检测
为了研究该纳米传感器对sirt1的特异性，本公开使用组蛋白去乙酰化酶hdac8作为干扰蛋白。hdac8是hdaci类锌依赖性酶，而hdaciii类的sirt1需要辅酶nad 。如图4b所示，在hdac8存在的情况下，既不会发生去乙酰化反应和生物素化反应，也不会发生基于qd的纳米传感器的构建。因此，没有观察到cy5信号。相反，在对sirt1的响应中检测到显著的cy5计数。这些结果表明该纳米传感器对sirt1具有高度特异性。
5.抑制剂分析
为了验证该方法在抑制实验的可行性，本公开使用ex-527作为sirt1抑制剂进行抑制分析。ex-527是烟酰胺(nam)的合成类似物，它可以抑制辅因子nad 的结合。图5显示了sirt1的相对活性随ex-527浓度的增加而降低。ex-527在纳摩尔浓度下抑制sirt1活性，其50％抑制浓度(ic50)值为47.3nm。所获得的ic50值与荧光酶法(38-98nm)获得的ic50值一致。
6.细胞的酶分析
为了验证该技术在实际样品方面的应用，检测了a549和hela细胞提取物中sirt1。图6a，a549和hela细胞样品得到cy5信号远高于控制组。从图6b可以看出，随着a549细胞数量的增加，cy5数量增加，在10-80000细胞范围内，cy5数量与细胞数的对数呈线性相关。回归方程为n＝6.10 252log10x(r2＝0.995)，其中n是cy5的计数，n是a549细胞数。计算出检测限为2个细胞。这些结果表明，提出的方法可以用于检测细胞中的sirt1酶。
所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
1.一种检测去乙酰化酶用纳米传感器，其特征是，所述纳米传感器包括带有赖氨酸乙酰基且有cy5标记的肽底物和被链霉亲和素包被的量子点，通过链霉亲和素-生物素化相互作用将所述肽连接到链霉亲和素修饰的量子点表面。
2.如权利要求1所述的一种检测去乙酰化酶用纳米传感器，其特征是，肽的赖氨酸被生物素化修饰，n末端cy5修饰；进一步地，底物序列为cy5-glu-lle-ala-gln-asp-phe-lys(ac)-thr-asp-leu-arg。
3.如权利要求1所述的一种检测去乙酰化酶用纳米传感器，其特征是，所述量子点为链霉亲和素包被的量子点；所述生物素化试剂选自sulfo-nhs-biotin、sulfo-nhs-lc-biotin或sulfo-nhs-ss-biotin；优选的，所述生物素化试剂为sulfo-nhs-biotin。
4.权利要求1所述的纳米传感器检测去乙酰化酶的检测方法，其特征是，具体检测方法如下：
(1)、将待检测样品加入至生物素化试剂，进行生物素化；
(2)、将步骤(1)获得的生物素化产物加入到含有量子点的缓冲溶液中孵育，获得检测去乙酰化酶用纳米传感器；
(3)、采用全内角反射荧光技术的单分子荧光成像系统对步骤(2)中的cy5的荧光信号进行检测，以定量检测待测样品中的去乙酰化酶。
5.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述待检测样品包括cy5标记的肽底物、sirt1、nad 和去乙酰化缓冲液；
进一步地，步骤(1)中，所述待检测样品的体积为10μl；所述cy5标记的肽底物的浓度为200-350μm，优选的，为300μm；
进一步地，步骤(1)中，所述nad 的浓度为0.5-2.0mm，优选的，为1mm；
进一步地，步骤(1)中，所述去乙酰化缓冲液的ph为8.0，包括20mmhepes，150mmnacl，2.7mmkcl，1mmmgcl2。
6.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，步骤(1)中，所述待检测样品进行生物素化之前，需要在30-45℃下孵育1-3个小时，得到去乙酰化产物；优选的，需要在37℃下孵育1.5小时。
7.如如权利要求6所述的检测方法，其特征是，将所得到的去乙酰化产物用生物素化试剂和hepes至总体积为50μl，进行生物素化反应；
进一步地，所述生物素化试剂的浓度为100-150μm，所述hepes的ph为7.0-9.0，浓度为10-30mm，优选的ph为8.0，浓度为20mm；
进一步地，所述生物素化反应的温度为10-30℃，反应时间为1-4h；优选的，所述反应的温度为20℃，反应时间为3h。
8.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，步骤(2)中，所述生物素化产物的体积为0.5-1.5μl；优选的，为0.9μl；
进一步地，所述步骤(2)中，量子点为605qd，所述605qd的浓度为8-23nm，优选的，为15nm；
进一步地，所述步骤(2)中，所述孵育缓冲溶液的体积为60μl，包括10mm(nh4)2so4，100mmtris-hcl，3mmmgcl2，ph8.0；
进一步地，所述孵育的条件是在室温下孵育10-30分钟，优选的，为20分钟。
9.如权利要求1所述的检测方法，其特征是，所述步骤(3)中，在成像之前，将步骤(2)中的纳米传感器在孵育缓冲液中稀释100-200倍，稀释后，将取5-15μl样品放在盖玻片上进行成像；优选的，以稀释150倍最佳。
10.权利要求1-3任一项所述的纳米传感器和/或权利要求4-9任一项所述检测方法在检测去乙酰化酶活性和/或筛选去乙酰化酶抑制剂和/或检测细胞中的去乙酰化酶中的应用。
技术总结