本发明涉及生物医学诊断分析方法技术领域，尤其是涉及一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法及应用。
背景技术：
现有生物化学和医学诊断体系中，主要是依靠单个信号分子的信号强度实现对单一目标物的定量分析。如基于免疫识别反应的酶联免疫吸附分析(elisa)使用紫外可见分光光度计监测紫外信号、电化学发光策略监测三吡啶钌等的电化学信号、荧光策略监测荧光染料的荧光信号(如fitc、fam等)等。
虽然，有少数研究者使用双信号分子实现目标分析，其主要是以一种信号分子为内标，以另外一个信号分子的变化而实现定量，即其被称之为比率策略。此外，以上比率策略中，两个信号分子间不存在相互作用，即严格讲体系仅仅对单个信号分子产生影响，并非是双信号策略。
技术实现要素：
本发明的目的之一在于提供一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，以解决现有技术中依靠单个信号分子实现目标物的定量，且难以可视化读取。此外，即使有少数研究者使用双信号分子实现目标分析，其为比率策略，也并非双信号策略的技术问题。
本发明的目的之二在于提供一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法的应用。
为了实现上述目的之一，本发明一实施例提供了一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，所述方法包括基于qds选择性识别cu2 和cu2 与ppi形成的复合物，以及ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐，以得到qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号，并基于qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号定量单一目标物。
根据一种优选实施方式，所述cu2 与ppi形成的复合物包括ppi-cu2 -ppi复合物。
根据一种优选实施方式，所述的基于qds选择性识别cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物以得到qds的荧光信号。包括利用qds与cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物进行选择性阳离子交换反应，基于cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物分别以不同程度淬灭qds荧光信号，以使各体系分别产生明显不同的可视化的颜色改变。
根据一种优选实施方式，所述cu2 可显著淬灭qds的荧光信号，所述ppi-cu2 -ppi复合物可抑制cu2 对qds荧光信号的淬灭。
根据一种优选实施方式，所述ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐以得到ppi-cecpns的荧光信号。包括利用ce3 与ppi和其它磷酸盐进行选择性配位聚合反应，形成的ppi-cecpns可发射荧光信号。
根据一种优选实施方式，所述ppi-cecpns的荧光信号在348nm处出峰，所述qds的荧光信号在670nm处出峰。
根据一种优选实施方式，所述qds包括cdteqds或者cdseqds。
为了实现上述目的之二，本发明一实施例提供了一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法的应用，所述应用包括将上述任一所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法应用于焦磷酸酶或者碱性磷酸酶的分析，所述焦磷酸酶或者所述碱性磷酸酶在室温或者37℃下孵育水解所述ppi。
根据一种优选实施方式，所述应用还包括用于有ppi参与的反应，所述反应包括pcr反应、rca反应或者tdt酶参与的核酸信号放大反应。
根据一种优选实施方式，所述应用还包括用于包含cu2 和ppi分析体系，结合多种信号放大策略，使用双荧光信号分子定量分析物。
本发明提供的一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，具有以下技术效果：
该种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，通过qds选择性识别cu2 和cu2 与ppi形成的复合物，以及通过ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐，以得到qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号，并基于qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号定量单一目标物。即使用双荧光信号分子，定量一种分析物，提高方法的准确性，同时将发光纳米材料ce3 引入生物化学和医学诊断中，实现可视化poct分析。
本发明提供的一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法的应用，具有以下技术效果：
该种多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法的应用可用于焦磷酸酶或者碱性磷酸酶的分析。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1所示为基于选择性识别反应的焦磷酸酶均相可视化和双荧光信号分析图；
图2所示为ppi-cecpns和qds双荧光分析体系建立的荧光谱峰和数据图；
图3所示为焦磷酸酶分析条件的优化图；
图4所示为焦磷酸酶分析性能图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。
所述poct，为即时检验(point-of-caretesting)，指在病人旁边进行的临床检测及床边检测((bedsidetesting)，通常不一定是临床检验师来进行。是在采样现场即刻进行分析，省去标本在实验室检验时的复杂处理程序，快速得到检验结果的一类新方法。
所述ppi为焦磷酸，分子式为h4p2o7，ppi是其在生物化学中的简写。
下面对本发明的技术方案进行详细说明。
本发明提供了一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，该分析方法包括基于qds选择性识别cu2 和cu2 与ppi形成的复合物，以及ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐，以得到qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号，并基于qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号定量单一目标物。优选地，cu2 与ppi形成的复合物包括ppi-cu2 -ppi复合物。优选地，基于qds选择性识别cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物以得到qds的荧光信号。包括利用qds与cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物进行选择性阳离子交换反应，基于cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物分别以不同程度淬灭qds荧光信号，以使各体系分别产生明显不同的可视化的颜色改变。优选地，cu2 可显著淬灭qds的荧光信号，ppi-cu2 -ppi复合物可抑制cu2 对qds荧光信号的淬灭。优选地，ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐以得到ppi-cecpns的荧光信号。包括利用ce3 与ppi和其它磷酸盐进行选择性配位聚合反应，形成的ppi-cecpns可发射荧光信号。
原理如下：
图1示出了基于选择性识别反应的焦磷酸酶均相可视化和双荧光信号分析图，如图1所示，基于两个选择性识别反应：
(1)cdteqds选择性识别cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物(ppi，焦磷酸盐)，如图1a所示；
(2)ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐，如图1b所示。
(3)利用焦磷酸酶水解ppi生成pi(磷酸)，而pi对cu2 无络合力，以及pi对ce3 荧光信号产生可忽略的影响的现象，可轻松构建ppase的双荧光信号均相可视化分析策略，如图1c所示为ppase的分析原理图所示。
cu2 可显著淬灭qds的荧光信号，而ppi与cu2 形成复合物后，其对qds的淬灭作用明显受到抑制，如图2c所示。ce3 可与ppi配位聚合形成纳米材料(ppi-cecpns)，且在348nm处发射荧光信号；而其它磷酸盐(pi等)对ce3 的荧光信号产生可忽略的影响，如图2d所示。
在以上现象的基础之上，结合ppi-cecpns在348nm处出峰，cdteqds在670nm处出峰，其间无光谱重叠，即可相互独立不影响。即利用以上两个信号分子定量单一目标物是可行的。在选择了信号分子后，利用ppi作为共用反应试剂，选择焦磷酸酶(ppase)为典型目标物，验证该双信号分析策略的可行性和适用性。
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。
实施例1：
本实施例提供了cdteqds的合成方法。
首先，将0.5mmolcdcl2和0.20g柠檬酸三钠溶解在50毫升水中，向以上溶液中加入52μl巯基丙酸(mpa)。使用naoh溶液，将以上混合物溶液ph调节至10.5；
然后，将0.1mmolna2teo3和50mgkbh4加入以上溶液中，回流1小时，至溶液呈红色，在紫外灯照射下呈现出强烈的红色荧光；
最后，通过沉淀(使用正丙醇)和离心(11000rpm，30分钟)纯化cdteqds溶液。
以上合成的mpa-cdteqds在使用前，保存在4℃温度下。
实施例2：
本实施例提供了ppase的分析步骤，具体如下：
(1)向离心管中依次加入77μltris-hcl缓冲液(ph＝7.4，10mm，500mmnacl，100mmmgcl2)，10μl焦磷酸(ppi，17.5mm)和50μl不同浓度焦磷酸酶(ppase)，于37℃下孵育0.5h完成水解反应；
(2)随后，向该离心管加入10μlcucl2溶液(100μm)，于37℃下继续孵育0.5h使铜离子和ppi络合；
(3)其次，向以上离心管中加入2μlce(no3)3溶液(0.5mm)和1μlcdteqds原液，室温下反应12min，完成阳离子交换反应和配位络合反应；
(4)将以上溶液转移至比色皿中，使用荧光仪测试并记录数据(激发波长：295nm，发射波长范围:310nm-800nm)。
实施例3：
本实施例提供了ppase分析-激发波长选择性和选择性性识别现象验证，具体如下：
考虑到ppi-cecpns所需最佳激发波长为295nm，cdteqds的最佳激发波长为365nm，故首先选择性了该双荧光信号分析体系的激发波长。如图2a所示，295nm激发时，ppi-cecpns和qds均有相应发射峰形，而选择365nm激发时，ppi-cecpns不在348nm处出峰，反而在365nm处显示出激发波长的峰形。
综上，最终选择性295nm为该体系的激发波长。
于此同时，进一步验证了不同浓度ppi-cu2 -ppi复含物对qds荧光信号的影响，以及不同ppi对ce3 荧光信号的影响。如图2b所示，随着ppi浓度增加，qds和ce3 的荧光信号均显著增加。
此外，分别对比了ppi和pi(ppi的ppase酶水解产物)对qds和ce3 荧光信号的影响，如图2c和2d所示，结果表明ppi对qds和ce3 荧光信号的影响明显强于pi，即验证了选择性阳离子交换反应和选择性配位聚合反应，同时也证实了该体系用于ppase分析是可行的。
实施例4：
本实施例提供了ppase分析-条件优化，具体如下：
在考察该ppase分析策略的分析性能之前，对其实验条件进行了优化。如图3所示，为焦磷酸酶分析条件的优化。
实验结果表明，ppi浓度为17.5mm，如图3a和3b所示；ppase水解ppi反应30分钟，如图3c所示；ppi与cu2 络合反应时间30分钟，如图3d所示；cu2 浓度为100μm，如图3e和图3f所示；qds原液体积为1μl，如图3g和图3h所示；qds与cu2 /ppi-cu2 -ppi间阳离子交换反应时间为12分钟，如图3i所示；ce3 浓度为0.5mm，如图3j和图3k所示；以及ppi/pi与ce3 反应时间8分钟，如图3l所示，为该体系的最佳实验条件。
实施例5：
本实施例提供了ppase分析性能，具体如下：
在实验条件优化之后，对该双荧光信号分析体系的ppase分析性能进行了考察，如图4所示。
首先，对使用qds为信号分子的可视化分析进行了评估。如图4a所示，在紫外灯照射下，5u/l的ppase酶可裸眼区分与空白溶液，且随着酶活性增加(1-125u/l)，溶液颜色在逐渐变浅。
当使用荧光仪对溶液荧光信号监测并线性拟合后，可发现pp-cecpns和qds体系均展示出随着ppase活性增加，荧光信号在降低的趋势，如图4b所示。
ppi-cecpns为信号分子体系在1-25u/l范围内呈现良好线性，其线性方程为y＝7300-190c(r2＝0.995)。与ppi-cecpns相似，qds为信号分子时，其在5-125u/l活性范围内线性良好，线性方程为y＝5079-32c(r2＝0.993)，如图4c所示。
以上两个信号分子对ppase分析检测限分别为0.15u/l和0.8u/l(源于三倍信噪比)。以上检测灵敏度，与现有无信号放大策略参与的体系相似，且操作更加简单，成本低。此外，鉴于正常人体内该ppase的含量在几百u/l左右，即该分析策略可满足临床检测需要。
随后，对抗干扰能力进行了考察，如图4d和4e所示，高浓度的潜在干扰蛋白对该体系荧光信号产生的影响与空白溶液相似(蛋白浓度为100nm，碱性磷酸酶alp为100u/l)，即其均为产生明显干扰。
值得注意的是，alp亦可水解ppi生成pi，然而其未产生影响，该现象为该体系在临床血清等样品中的应用奠定了良好基础。相比与高浓度的干扰蛋白，低浓度的ppase酶(10，25，100u/l)引起了荧光信号的显著降低。
综上，该双荧光信号ppase分析体系具有良好的选择性。
由以上内容可知，ppi-cecpns在348nm处出峰，cdteqds在670nm处出峰，其间无光谱重叠，即可相互独立不影响，即使用双荧光信号分子，定量一种分析物，提高方法的准确性，同时将发光纳米材料ce3 引入生物化学和医学诊断中，实现可视化poct分析。
本发明的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，能够通过基于对ppi-cecpns和qds双荧光信号的改变，得到基于单一目标物的分析结果，可以将其应用于以下分析中：
(1)焦磷酸酶或者碱性磷酸酶的分析，焦磷酸酶或者碱性磷酸酶在室温或者37℃下可孵育水解ppi。
(2)有ppi参与的反应，反应为多种核酸聚合反应，包括pcr反应、rca反应或者tdt酶等参与的核酸放大反应。
(3)包含cu2 和ppi分析体系，结合多种信号放大策略，使用双荧光信号分子定量分析物。
以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。
1.一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述方法包括基于qds选择性识别cu2 和cu2 与ppi形成的复合物，以及ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐，以得到qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号，并基于qds的荧光信号和ppi-cecpns的荧光信号定量单一目标物。
2.根据权利要求1所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述cu2 与ppi形成的复合物包括ppi-cu2 -ppi复合物。
3.根据权利要求2所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述的基于qds选择性识别cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物以得到qds的荧光信号。包括利用qds与cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物进行选择性阳离子交换反应，基于cu2 和ppi-cu2 -ppi复合物分别以不同程度淬灭qds荧光信号，以使各体系分别产生明显不同的可视化的颜色改变。
4.根据权利要求3所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述cu2 可显著淬灭qds的荧光信号，所述ppi-cu2 -ppi复合物可抑制cu2 对qds荧光信号的淬灭。
5.根据权利要求1所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述ce3 选择性识别ppi和其它磷酸盐以得到ppi-cecpns的荧光信号。包括利用ce3 与ppi和其它磷酸盐进行选择性配位聚合反应，形成的ppi-cecpns可发射荧光信号。
6.根据权利要求1所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述ppi-cecpns的荧光信号在348nm处出峰，所述qds的荧光信号在670nm处出峰。
7.根据权利要求1所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法，其特征在于，所述qds包括cdteqds或者cdseqds。
8.一种基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法的应用，其特征在于，所述应用包括将权利要求1-7任一所述的基于多种选择性识别反应的均相可视化和双荧光信号分析方法应用于焦磷酸酶或者碱性磷酸酶的分析，所述焦磷酸酶或者所述碱性磷酸酶在室温或者37℃下孵育水解所述ppi。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用还包括用于有ppi参与的反应，所述反应包括pcr反应、rca反应或者tdt酶参与的核酸信号放大反应。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述应用还包括用于包含cu2 和ppi分析体系，结合多种信号放大策略，使用双荧光信号分子定量分析物。
技术总结