一种银杏内酯的检测方法与流程

1.本发明涉及一种银杏内酯的检测方法，属于复杂样品前处理及药物分析化学领域。


背景技术：

2.银杏是一种裸子植物落叶乔木，我国自古以来就有银杏叶入药和食疗的记载。20世纪70年代初在国外特别是欧洲利用银杏叶提取物来治疗心脑血管疾病包括脑血管动脉粥样硬化和中枢外周血流紊乱的研究出现，其药用价值受到了更为广泛的关注。银杏叶提取物的有效成分主要包括黄酮类和萜类内酯类等，其中萜类内酯类为血小板活化因子及甘氨酸受体特异性拮抗剂，具有广泛的药理作用，在预防、治疗心脑血管疾病及保护中枢神经系统方面显示了较好的市场前景。因此，实现对银杏叶提取物中萜类内酯总含量的准确测定是银杏叶制剂质量控制的关键指标之一，其中白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c四种成分的总含量则是常用的评价指标。
3.由于植物自身成分极为复杂，实现对银杏叶提取物所含白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c的准确测定必然需要依托一定的分离净化手段。目前常用的前处理方法主要参考《中国药典》，但是在应用的过程中发现，由于前处理相对简单，只依靠乙酸乙酯固液萃取，并不能实现很好的净化效果，检测稳定性也较差，日间rsd的5％～10％左右。同时经过研究发现，该方法中的4次乙酸乙酯萃取并不能将银杏内酯充分萃取，随着萃取遍数的增加，内酯含量持续增加，说明银杏内酯的含量检测结果偏低。目前国内外的研究也一直围绕在银杏内酯的前处理方法上，如引入硅藻土、树脂、固相萃取、结晶等净化手段，但是目前仍然没有对其有较大的改善。
4.本申请为解决这一难题，将银杏内酯的前处理方法进行一系列的改进，最终使银杏内酯的检测精度和准确性得到明显提升。


技术实现要素：

5.本发明的目的是提供一种银杏内酯的检测方法，包括检测前的提取、净化步骤和检测步骤，主要用于银杏叶提取物中萜类内酯类的准确定量，尤其是白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c四种成分的含量的准确测定。
6.为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
7.一种银杏内酯的检测方法，包括以下步骤：
8.(1)称取银杏叶提取物，并向其中加入90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入ph值为4.8～6.2的10～50mmol/l磷酸盐缓冲溶液形成银杏叶提取物分散液；
9.(2)向步骤(1)的分散液中加入merck硅藻土，将其置于振荡器中，在一定的条件下处理30～60min，然后将其转移至滤纸筒中；
10.(3)将步骤(2)的滤纸筒装入索氏提取装置，以乙酸乙酯为溶剂，在一定温度下索氏抽提0.5～3h，提取结束后将得到的提取液冷却至室温；
11.(4)将步骤(3)得到的提取液浓缩至固含量大于90％，然后加入50％的甲醇水溶液溶液，在4～10℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液；
12.(5)将步骤(4)得到的上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测得到各组分的色谱峰。
13.(6)根据步骤(5)得到的色谱峰，通过峰面积对其中的白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b以及银杏内酯c的含量分别进行计算，加和得到银杏内酯的含量。
14.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(1)中90％的甲醇水溶液与银杏叶提取物的体积质量比为1:1～8:1，所述磷酸盐缓冲溶液与银杏叶提取物的体积质量比为20:1～400:1。
15.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(2)中merck硅藻土与银杏叶提取物的质量比为50:1～500:1。
16.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(2)的处理条件为温度20～60℃、转速50～100rpm。
17.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(3)中乙酸乙酯与银杏叶提取物的体积质量比为400:1～2000:1。
18.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(3)中索氏提取的温度为200～250℃。
19.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(4)中50％甲醇溶液与银杏叶提取物的体积质量比为10:1～200:1。
20.本发明技术方案的进一步改进在于：所述步骤(5)的检测色谱条件为：选取eclipse plus c18、100*4.6mm、3.5μm色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱，蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。
21.由于采用了上述技术方案，本发明取得的技术效果有：
22.本发明对银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b和银杏内酯c具有稳定、良好的提取及净化能力；本发明检测结果稳定性好，精度和准确性明显提升，实现了对银杏叶提取物中萜类内酯总含量的准确测定。
23.银杏叶提取物在90％的甲醇水溶液中溶解后能够在缓冲液中得到充分的扩散；使用ph值为4.8～6.2磷酸缓冲液分散，以使merck硅藻土能够得到有效的吸附杂质、纯化有效物质。
24.使用乙酸乙酯进行索氏提取，乙酸乙酯对银杏内酯的选择性较好，索氏的动态提取能够将银杏内酯充分的提取，这是静态吸附解析所不能比拟的。
附图说明
25.图1是本发明银杏提取物分散液的高效液相色谱仪联用蒸发光散射检测器分析色谱图；
26.其中，1a、采用本发明步骤(1)处理得到的银杏提取物分散液的高效液相色谱仪联用蒸发光散射检测器分析色谱图，1b、采用本发明步骤(1)～(5)处理得到的银杏提取物分散液的高效液相色谱仪联用蒸发光散射检测器分析色谱图，1c、混合标准品液色谱图(白果内酯浓度为0.524mg/ml、银杏内酯a浓度为0.428mg/ml、银杏内酯b浓度为0.304mg/ml、银杏
内酯c浓度为0.070mg/ml)。
具体实施方式
27.下面将结合具体实施例对本发明做进一步详细说明：
28.一种银杏内酯的检测方法，先对银杏叶提取物进行提取、净化，再对处理得到的提取上清液进行检测。具体包括以下步骤：
29.(1)称取银杏叶提取物，并向其中加入银杏叶提取物质量1～8倍体积的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入银杏叶提取物质量20～40倍体积的ph值为4.8～6.2的10～50mmol/l磷酸盐缓冲溶液形成银杏叶提取物分散液；
30.(2)向步骤(1)的分散液中加入银杏叶提取物质量50～500倍的merck硅藻土，将其置于振荡器中，在30℃、50～100rpm的条件下处理30～60min。然后将其转移至滤纸筒中；
31.(3)将步骤(2)的滤纸筒装入索氏提取装置，以银杏叶提取物质量400～2000倍体积的乙酸乙酯为溶剂，在200～250℃下索氏抽提0.5～3h，提取结束后将得到的提取液冷却至室温；
32.(4)将步骤(3)得到的提取液浓缩至固含量大于90％，然后加入银杏叶提取物质量10～200倍体积的50％甲醇水溶液，在4～10℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液；
33.(5)将步骤(4)得到的上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。其色谱条件为：选取eclipse plus c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱，蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。
34.(6)根据步骤(5)得到色谱峰，对其中的白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b以及银杏内酯c的含量分别进行计算后加和得到银杏内酯的含量。
35.实施例1
36.称取0.1g银杏叶提取物加入0.5ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入10ml的ph值为5.8的20mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土10g，将其置于振荡器中，在30℃、60rpm的条件下处理30min。然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以100ml乙酸乙酯为溶剂，在250℃下进行索氏抽提1.5h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0037][0038]
实施例2
[0039]
称取0.1g银杏叶提取物加入1ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入20ml的ph值为4.8的50mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土15g，将其置于振荡器中，在30℃、100rpm的条件下处理60min，然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以150ml乙酸乙酯为溶剂，在200℃下进行索氏抽提3h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入10ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0040][0041]
实施例3
[0042]
称取0.1g银杏叶提取物加入0.25ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入5ml的ph值为6.2的10mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土5g，将其置于振荡器中，在30℃、100rpm的条件下处理40min，然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以50ml乙酸乙酯为溶剂，在220℃下进行索氏抽提2h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入2.5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0043]
[0044][0045]
对比例1
[0046]
按照中国药典的方法进行检测，取银杏叶提取物0.15g，加水10ml，置水浴中温热使溶散，加入2％盐酸溶液2滴，用乙酸乙酯振摇提取4次(15ml、10ml、10ml、10ml)合并提取液，用5％醋酸钠溶液20ml洗涤，分出醋酸钠液，再用乙酸乙酯10ml洗涤，合并乙酸乙酯液，利用旋转蒸发仪浓缩至干，然后用甲醇溶解并转移至5ml容量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，收集滤液即得。分别精密吸取对照品溶液5μl、10μl，供试品溶液10μl，注入液相色谱仪，测定，液相条件为：c18柱，正丙醇
‑
四氢呋喃
‑
水(1:15:84)为流动相，流速0.7ml/min，柱温箱温度30℃。漂移管温度100℃，气体流速2.7l/min。结果如下表所示：
[0047][0048]
对比例2
[0049]
精确称取银杏叶提取物0.75g，在磁力搅拌的条件下用乙酸乙酯在40℃下提取3次(分别用150ml、100ml、100ml)，每次10min，合并提取液，利用旋转蒸发仪浓缩至干，样品用甲醇溶解并转移至25ml容量瓶中，最后利用甲醇定容，摇匀，以0.45μm滤膜过滤，收集滤液即得。然后利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为c18柱，流动相流速0.7ml/min，柱温箱温度30℃。蒸发光散射检测器条件：漂移管温度100℃，气体流速2.7l/min。流动相条件：有机相甲醇加水相。结果如下表所示：
[0050][0051]
对比例3
[0052]
称取0.1g银杏叶提取物加入0.5ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入10ml ph值为5.8的20mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土10g，将其置于振荡器
中，在30℃、60rpm条件下处理30min。然后将其整体转移至层析柱中，用500ml的乙酸乙酯进行洗脱，收集洗脱液，浓缩至固含量大于90％。此后加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mmol/l，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0053][0054]
对比例4
[0055]
称取0.1g银杏叶提取物加入0.5ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入10ml ph值为5.8的20mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土10g，将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以100ml乙酸乙酯为溶剂，在250℃下进行索氏提取1.5h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0056][0057]
对比例5
[0058]
称取0.1g银杏叶提取物加入10ml的ph值为5.8的20mmol/l磷酸盐缓冲溶液，超声处理10min。加入merck硅藻土10g，将其置于振荡器中，在30℃、60rpm条件下处理30min。然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以100ml乙酸乙酯为溶剂，在250℃下进行索氏提取1.5h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的
漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0059][0060][0061]
对比例6
[0062]
称取0.1g银杏叶提取物加入0.5ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入10ml ph值为5.8的20mmol/l磷酸盐缓冲溶液。加入merck硅藻土10g，将其置于振荡器中，在30℃、60rpm条件下处理30min。然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，以100ml乙酸乙酯为溶剂，在250℃下进行索氏提取1.5h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用尼龙材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0063][0064]
对比例7
[0065]
称取0.1g银杏叶提取物加入0.5ml的90％的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入10ml纯水，利用盐酸调节ph至5。加入merck硅藻土10g，将其置于振荡器中，在30℃、60rpm条件下处理30min。然后将其整体转移至滤纸筒中。此后将滤纸筒装入索氏提取装置，在250℃下进行索氏提取1.5h，提取结束后冷却至室温，然后浓缩至固含量大于90％。加入5ml 50％的甲醇水溶液溶液，在4℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液。将上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测。液相条件为：c18(100*4.6mm，3.5μm)色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱。蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。结果如下表所示：
[0066][0067]
各实施例及对照例的银杏内酯含量的rsd结果对比见下表：
[0068][0069]
如上表所示：本发明检测方法的检测稳定、精确度和准确性较中国药典方法及其他方法得到了显著地提升，检测结果的rsd均小于0.5％，实现了对银杏叶提取物中萜类内酯总含量的准确测定。

技术特征：
1.一种银杏内酯的检测方法，其特征在于包括以下步骤：（1）称取银杏叶提取物，并向其中加入90%的甲醇水溶液，超声处理10min，然后再加入ph值为4.8～6.2的10～50mmol/l磷酸盐缓冲溶液形成银杏叶提取物分散液；（2）向步骤（1）的分散液中加入merck硅藻土，将其置于振荡器中，在一定的条件下处理30～60min，然后将其转移至滤纸筒中；（3）将步骤（2）的滤纸筒装入索氏提取装置，以乙酸乙酯为溶剂，在一定温度下索氏抽提0.5～3h，提取结束后将得到的提取液冷却至室温；（4）将步骤（3）得到的提取液浓缩至固含量大于90%，然后加入50%的甲醇水溶液溶液，在4～10℃、10000rpm下离心5～10min，得上清液；（5）将步骤（4）得到的上清液利用ptfe材质的滤膜过滤后，利用高效液相串联蒸发光散射检测器进行检测得到各组分的色谱峰；（6）根据步骤（5）得到的色谱峰，通过峰面积对其中的白果内酯、银杏内酯a、银杏内酯b以及银杏内酯c的含量分别进行计算，加和得到银杏内酯的含量。2.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（1）中90%的甲醇水溶液与银杏叶提取物的体积质量比为1:1～8:1，所述磷酸盐缓冲溶液与银杏叶提取物的体积质量比为20:1～400:1。3.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）中merck硅藻土与银杏叶提取物的质量比为50:1～500:1。4.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（2）的处理条件为温度20～60℃、转速50～100rpm。5.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中乙酸乙酯与银杏叶提取物的体积质量比为400:1～2000:1。6.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（3）中索氏提取的温度为200～250℃。7.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（4）中50%甲醇溶液与银杏叶提取物的体积质量比为10:1～200:1。8.根据权利要求1所述的一种银杏内酯的检测方法，其特征在于：所述步骤（5）的检测色谱条件为：选取eclipse plus c18、100*4.6mm、3.5μm色谱柱，柱温40℃，流动相为甲醇和水，进行梯度洗脱，蒸发光散射器的漂移管稳定设定为110℃，气体流量为3.0l/min。
技术总结
本发明涉及一种银杏内酯的检测方法，属于复杂样品前处理及药物分析化学领域，具体步骤包括对银杏叶提取物检测前的提取、净化和检测，本发明对银杏叶提取物中白果内酯、银杏内酯A、银杏内酯B和银杏内酯C具有稳定、良好的提取及净化能力，检测结果稳定性好，精确度和准确性明显提升，RSD可小于0.5%。RSD可小于0.5%。


技术研发人员：程远欣 杨甲甲 张晓芳 葛亚哲 徐猛
受保护的技术使用者：晨光生物科技集团股份有限公司
技术研发日：2020.11.17
技术公布日：2021/3/9