本发明属电流型传感器技术领域，更具体地，涉及一种nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极及其制备方法和应用。
背景技术：
葡萄糖普遍存在于植物的组织器官中，是植物光合作用的产物，是植物生理代谢活动的最主要能量来源，在植物生长发育过程中起着非常重要的调节作用。鉴于葡萄糖对植物生长发育有重要调控作用，有效测定植物体中葡萄糖的含量十分必要。目前测定葡萄糖的常规方法有高效液相色谱方法、离子色谱法，碘量法，电化学传感法等。相对于其他检测方法，电化学传感法具有响应时间短、准确度高、前处理要求低、操作简便、成本低等优点，所以葡萄糖电化学传感器成为近几十年来研究的热点，展示出良好的传感性能(检出限、灵敏度、选择性以及稳定性等)。其原理是利用对待测物敏感的元件作为检测头，将待测物的浓度转换成电信号，从而进行测定。
根据用于识别葡萄糖分子的传感元件不同，葡萄糖电化学传感器大致可分为两类：酶基葡萄糖电化学传感器和无酶葡萄糖电化学传感器。从1973年至今，已开发出三代酶基葡萄糖电化学传感器，前两代酶基葡萄糖传感器均发生间接电催化过程，其主要缺点是必须有媒介体的参与，因此传感器结构复杂，限制了它们的进一步应用，而第三代酶基葡萄糖传感器属于直接电催化，无需加入电子媒介体，电极和酶的活性氧化还原位点是电连接的，酶自身与电极之间能直接发生电子转移，可有效地将葡萄糖的酶识别事件转换为电流信号，是一种非常理想的酶基传感器。在葡萄糖检测的应用研究中，构建新型、高效的无酶葡萄糖传感器是传感器研发领域的重点。该类传感器多应用于人体的血糖水平检测，辅助进行糖尿病临床诊断与医疗监测。例如，lei等人以贵金属(铂或者金)纳米颗粒和纳米纤维构建了无酶电化学传感器，该传感器葡萄糖检测范围为4μmol/l～15mmol/l(leitingzhou,donglili,zhangxiuqiang,rensuxia,wuqinglin,chengaofeng,yanguihua.metalnanoparticles/nanocellulosecomposites-basednon-enzymaticelectrochemicalglucosesensorandpreparationmethodthereof[p].：us2017276640,2017-09-28.)。马占芳和石文韬则利用葡萄糖氧化酶和三角银纳米颗粒研制了一种用于血糖检测的葡萄糖传感器，检测范围为3～20μmol/l，仅限于低浓度葡萄糖含量的检测(马占芳,石文韬.一种葡萄糖传感器及其制备方法和应用[p].北京：cn102621207a,2012-08-01)。对于动植物检测应用方面，该类传感器应用将满足生物、农业和食品等领域的生产商品葡萄糖检测的需求。尤其是在农业领域，葡萄糖是植物光合作用的产物，在植物生理代谢活动中起着非常重要的作用。在植物的生长发育过程中发挥重要功能的能量与信号物质，糖类的合成，转运，代谢，储存，贯穿着光合植物的整个生长周期。复杂的糖代谢和信号转导网络通过整合植物内部调节因子和外部环境因子来调控及维持植物的生长和存活。其中葡萄糖是作为最为主要的糖类调节信号，在控制着基因和蛋白的表达、细胞周期、初生和次生代谢，以及生长和发育进程等方面都发挥着非常重要的信号传导作用(sheenj.masterregulatorsinplantglucosesignalingnetworks[j].journalofplantbiology,2014,57(2),67-79)。同时研究表明，葡萄糖信号转导和多种植物激素间存在互作关系，如乙稀、生长素和细胞分裂素等(filiprolland,elenabaena-gonzalez,jensheen.sugarsensingandsignalinginplants:conservedandnovelmechanisms[j].annualreviewofplantbiology.2006,57,675-709)。就传统而言，对于植物葡萄糖含量的检测，我们通常是使用高效液相色谱法，离子色谱法，化学碘量法等。这些检测方法非常耗时且成本较高，因此采用快速，低成本，精确的电化学方法进行植物中葡萄糖含量的检测无疑是一个非常好的选择。基于电化学传感方法检测植物组织中葡萄糖含量的研究还处于起步阶段，应用推广条件有待进一步成熟。
技术实现要素：
为了解决上述现有技术存在的不足和缺点，本发明首要目的在于提供一种nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极。
本发明的另一目的是提供上述nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的制备方法。
本发明的再一目的是提供上述nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制备的葡萄糖传感器在检测植物体内葡萄糖中的应用。
本发明的目的通过下述技术方案来实现：
一种nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，所述nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极是将铂丝进行电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构，制得纳米多孔铂电极；再将所得纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，组成三电极体系，将其插入到超声处理的氧化石墨烯水溶液中，采用循环伏安法将氧化石墨烯沉积到纳米多孔铂电极表面，制得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；然后将所得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极在0～4℃浸泡在葡萄糖氧化酶的pbs溶液中，在电极上固定葡萄糖氧化酶，制得葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；最后将nafion溶液滴涂到葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的表面，干燥制得。
优选地，所述的纳米多孔铂电极是将打磨清洗后的铂丝电极作为阳极，石墨棒作为阴极接入直流电源，电源电压为20～30v，用nah2po4溶液作为电解液，在保持电解液的搅拌状态下，对铂丝进行电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构制得。
更为优选地，所述的nah2po4溶液的浓度为0.1～1mol/l，所述的搅拌的速度为200～500r/min，所述的电化学腐蚀的时间为15～30min。
优选地，所述的氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5～5mg/ml，所述的葡萄糖氧化酶的pbs溶液的浓度为50～150unit/ml。
优选地，所述的nafion溶液是将全氟磺酸溶解在乙醇中，所述的nafion溶液的浓度为0.5～1wt％。
优选地，所述的循环伏安法的参数为：扫描速率0.5～1mv/s，扫描次数为4～22圈；高电位为0～-0.2v，低电位为-1～-1.2v；所述的沉积的时间为2～24h。
优选地，所述的超声处理的时间为5～30min；所述的浸泡的时间为4～24h。
所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的制备方法，包括如下具体步骤：
s1.将打磨清洗后的铂丝电极作为阳极，石墨棒作为阴极接入直流电源，电源电压为20～30v，用nah2po4溶液作为电解液，在保持电解液的搅拌状态下，对铂丝进行15～30min的电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构，制得纳米多孔铂电极；
s2.将所得纳米多孔铂电极作为工作电极，另一铂丝电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，组成三电极体系，将其插入到超声处理的氧化石墨烯水溶液中，采用循环伏安法将氧化石墨烯沉积到纳米多孔铂电极表面，沉积完成后，取出电极，用去离子水冲洗，再用氮气吹干，制得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；
s3.将所得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极在0～4℃浸泡在葡萄糖氧化酶的pbs溶液中，进行葡萄糖氧化酶的吸附，在电极上固定葡萄糖氧化酶，制得葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；
s4.将nafion溶液滴涂到葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的表面，干燥，制得nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极。
所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制备的葡萄糖传感器在检测植物体内葡萄糖中的应用。
进一步地，所述的葡萄糖传感器是以nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极。
所述葡萄糖传感器检测植物组织内葡萄糖的方法如下：
b1.以pbs溶液为溶剂，分别配制成浓度0～20mmol/l的葡萄糖标准溶液，建立标准溶液体系；
b2.将nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，以铂丝作为对电极，以ag/agcl作为参比电极，在-0.8～0v电压范围内，采用差分脉冲伏安法，分别检测不同浓度的葡萄糖标准溶液，获得相应的电流-电压曲线；
b3.根据不同浓度的葡萄糖标准溶液的电流-电压曲线在-0.4～-0.5v处的峰电流作为定量指标；以葡萄糖浓度为横坐标，峰电流作为纵坐标，利用函数方程进行拟合，从而建立其峰电流与葡萄糖浓度之间的定标函数；
b4.采用差分脉冲伏安法检测植物组织待测液，获得电流-电压曲线，提取-0.4～-0.5v处的峰电流代入步骤b3的定标函数，得到植物组织待测液中葡萄糖的浓度。
本发明采用电化学处理法，获得了具有三维纳米结构的氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，该结构将为葡萄糖氧化酶的吸附和固定提供优化的电极表面，促使更多的葡萄糖氧化酶能够吸附在三维纳米结构上，以增加葡萄糖传感器的工作电流。另一方面，nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的结构能够实现葡萄糖氧化酶的直接电化学催化，构建葡萄糖氧化酶分子的氧化还原活性核心黄素腺嘌呤二核苷酸(fad)与铂电极的直接电子交换，有效促进了工作电极表面催化电流的提高，也增加了葡萄糖传感器的工作电流。工作电流的增加有利于传感器灵敏度的提升。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1.本发明的通过电化学方法对电极进行多次修饰，制得nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其中，纳米多孔铂具有独特的表面结构、良好的导电性；氧化石墨烯具有高电子转移率、良好的电催化活性和高吸附性；葡萄糖氧化酶具有催化葡萄糖氧化的生物活性功能；全氟磺酸(nafion)作为高分子聚合物膜，具有封装保护纳米结构电极和提高电极界面电荷输运效率的作用。
2.本发明的制备方法具有操作简单的优势，所形成的微观电极界面有利于固定葡萄糖氧化酶分子；所制备的葡萄糖生物传感器具有高灵敏度(可达15.30μa(mmol/l)-1cm-2)、强抗干扰性和快速响应(可达2.8秒)；采用差分脉冲伏安法检测时，在检测过程中添加干扰物，如结构功能与葡萄糖类似的果糖、抗坏血酸等物质，能够保持测试结果不受干扰物影响。
3.本发明所提供的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的葡萄糖传感器可用于检测植物组织中的葡萄糖含量，检测范围可达0～20mmol/l，传感器成本低，有利于民用化，具有很好的应用价值。
附图说明
图1为实施例1中氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的sem照片；
图2为不同腐蚀时长的纳米多孔铂电极的sem照片。
图3为采用实施例1中的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制得的葡萄糖生物传感器所测试的不同浓度葡萄糖溶液的差分脉冲伏安曲线；
图4为实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器采用差分脉冲伏安法对电流-电压曲线的定量指标，所提取的葡萄糖标准溶液浓度和峰电流的测试数据点和定标函数图。
图5为采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器在1mmol/l的葡萄糖标准溶液中添加抗坏血酸和果糖的差分脉冲伏安法对比曲线。
图6为采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器测试电流-时间的响应曲线，其中葡萄糖标准溶液的浓度变化条件为1mmol/l。
具体实施方式
下面结合具体实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
本发明实施例中所用的试剂分别购于：pbs缓冲溶液(ph＝7.4(广东广式试剂科技有限公司)；二水合磷酸二氢钠(99.0％，广东广式试剂科技有限公司)葡萄糖(99％，广东广式试剂科技有限公司)；葡萄糖氧化酶(40unit/mg，九鼎化学(上海)科技有限公司)；单层氧化石墨烯(99％，苏州碳丰科技有限公司)；乙酸锌(98.0％，广东广式试剂科技有限公司)；亚铁氰化钾(99.5％，广东广式试剂科技有限公司)；无水乙醇(997％，上海凌峰化学试剂有限公司)；冰醋酸(乙酸)(99.5％，广东广式试剂科技有限公司)。
本发明实施例中所涉及的仪器及型号如下：直流电源：snx-30v5a，上海钡思那电子科技有限公司。电化学工作站：chi760c，上海辰华仪器有限公司。
实施例1
一种固定葡萄糖氧化酶的电极的制备方法，包括以下步骤：
1.对铂丝电极进行处理，在其表面制备出纳米多孔结构，具体处理方法如下：
a)取直径0.5mm，长度10mm的铂丝电极，用涂敷有0.03μmal2o3的润湿麂皮打磨5min，去除铂丝的表面氧化物；然后清洗铂丝电极，用去离子水、乙醇分别超声清洗10min，用氮气吹干。
b)将清洁后的铂丝电极作为阳极，石墨棒(直径0.5mm，长度8cm)作为阴极，一端接入直流电源，另一端则插入0.3mol/l的nah2po4电解液中；在电解液中放入转子后置于磁力搅拌器上，搅拌的速度为300r/min；在保持电解液的搅拌状态下，打开直流电源开关，选择工作电压30v，对铂丝电极进行电化学腐蚀20min，腐蚀完成后，制得纳米多孔铂电极，然后对其进行清洗，用去离子水、乙醇分别超声清洗10min，用氮气吹干，备用。
2.将步骤1所得纳米多孔铂电极作为工作电极，另一铂丝电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，组成三电极体系，将其插入到1mg/ml的氧化石墨烯水溶液(溶剂为去离子水)中，采用循环伏安法将氧化石墨烯沉积到纳米多孔铂电极表面，所述的循环伏安法的参数为：扫描速率0.5～1mv/s，扫描次数为4～22圈；高电位为0～-0.2v，低电位为-1～-1.2v；所述的沉积的时间为2～24h。沉积完成后，取出电极，用去离子水冲洗，再用氮气吹干，制备出氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，如图1所示。图1为氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的sem照片。从图1中可知，铂电极表面形成了大量致密的纳米孔，同时在表面沉积了一层氧化石墨烯，形成了三维混合纳米结构。采用循环伏安法测试所制得的氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的有效表面积为0.166cm2。
3.将步骤2所得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极插入到浓度为100unit/ml的葡萄糖氧化酶pbs溶液中，并在温度为4℃的环境中存放8h，取出得到葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极。
4.取2μl0.5％nafion溶液均匀滴涂到步骤3所得葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极表面，并用氮气吹干，重复操作3次，得到nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极。
图2为不同腐蚀时长的所得纳米多孔铂电极的sem照片。其中，(a)为电化学腐蚀10分钟；(b)为电化学腐蚀15分钟；(c)为电化学腐蚀20分钟；(d)为电化学腐蚀30分钟。从图2中可知，经过电化学腐蚀后，铂丝电极表面会形成纳米多孔状结构。当腐蚀时间较短时(10分钟，15分钟)，铂丝表面无法得到充分腐蚀，表面由光滑变成粗糙多坑，孔隙较大，孔数量较少，该种形貌特征的表面，难以固定更多数量的葡萄糖氧化酶分子。而当电化学腐蚀时间至30分钟时，铂丝表面则形成丘壑纵横的结构形貌，而且出现部分的表面纳米孔层解离、剥落至电解液中的现象。该种形貌特征的表面，也将难以成为固定大量葡萄糖氧化酶分子的优选。腐蚀时间为20分钟的铂丝样品，其表面形成了致密的纳米孔状结构，该种形貌特征将为固定大量的葡萄糖氧化酶提供良好的物理空间结构。
测试例1
以实施例1的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器可用于葡萄糖含量检测，确定定标函数的方法为：
1)以pbs溶液(ph＝7.4)为溶剂配制浓度为0、1、2、3、4、8、12、16、20mmol/l的葡萄糖标准溶液，建立标准溶液体系；
2)将nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，以铂丝作为对电极，以ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器，在-0.8～0v电压范围内，采用差分脉冲伏安法分别检测不同浓度的葡萄糖标准溶液，获得相应的电流-电压曲线。
3)根据不同浓度标准葡萄糖溶液的电流-电压曲线，获取在-0.4～-0.5v处的峰电流，以0mmol/l浓度葡萄糖溶液的dpv峰电流指标为基准电流，其余各浓度溶液的dpv峰电流分别扣减上述基准电流，作为定量指标。以葡萄糖浓度为横坐标，峰电流作为纵坐标，利用函数方程进行拟合，从而建立其峰电流与葡萄糖浓度之间的定标函数；
4)采用差分脉冲伏安法检测植物组织待测液，获得电流-电压曲线，提取-0.4～-0.5v处的峰电流代入步骤3)的定标函数，得到植物组织待测液中葡萄糖的浓度。
不同浓度溶液中葡萄糖的浓度以及其相对应的定量指标(扣减基准后的峰电流)如表1所示。按照表1中列出的数据，以葡萄糖浓度为横坐标，定量指标(扣减基准后的峰电流)作为纵坐标，得到不同浓度的葡萄糖标准溶液的浓度和电流的数据点图，如图3所示。图3为采用实施例1中的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制得的葡萄糖生物传感器所测试的不同浓度葡萄糖溶液的差分脉冲伏安曲线(ag/agcl电极为参比电极，铂丝电极为对电极)。从图3中可知，在不同浓度的葡萄糖溶液中，得到的差分脉冲伏安曲线不同，随着葡萄糖浓度的上升，其差分脉冲伏安曲线的峰电流也随即上升，即随着葡萄糖浓度的增加，差分脉冲伏安曲线的峰电流也相应增加的趋势关系。该传感器在0～20mmol/l范围，具有对葡萄糖浓度变化的响应趋势，因此，该传感器的测量范围为0～20mmol/l。该趋势关系的函数拟合方法如下：
基于酶促反应的原理用所nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制备的葡萄糖生物传感器检测葡萄糖，采用米氏方程拟合上述葡萄糖浓度和电流的定标函数。图4为实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器采用差分脉冲伏安法电流-电压曲线的定量指标，所提取的葡萄糖标准溶液浓度和峰电流的测试数据点和定标函数图。根据表1数据拟合后，得到葡萄糖的定标函数为：y＝21.4x/(6.45 x)，(r2＝0.974)，其中，y为葡萄糖的浓度，x为扣减基准电流后的峰电流。
表1不同浓度溶液中葡萄糖的浓度以及其相对应的定量指标
具体地，用表1数据计算可得，0～1mmol/l的灵敏度为(21.94-19.4)μa/(1mmol/l)/0.166cm2＝15.30μa(mmol/l)-1cm-2。采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器，用差分脉冲伏安法，分别测试1mmol/l葡萄糖标准溶液、1mmol/l抗坏血酸 1mmol/l葡萄糖样品溶液以及1mmol/l果糖 1mmol/l葡萄糖样品溶液，获得对比曲线如图5所示。图5为采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器在1mmol/l的葡萄糖标准溶液中添加抗坏血酸和果糖的差分脉冲伏安法对比曲线。从图5中可知，-0.4～-0.5v的峰电流变化很小，说明传感器对干扰物抗坏血酸和果糖具有强抗干扰能力。
采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器，用时间-电流法，测试葡萄糖标准溶液的浓度变化1mmol/l的时间响应，获得响应曲线如图6所示。图6为采用实施例1中nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器测试电流-时间的响应曲线，其中葡萄糖标准溶液的浓度变化条件为1mmol/l。从图6中可知，当葡萄糖标准溶液发生变化时，传感器的工作电流随即增加，在2.8秒内达到电流最大变化的95％，因此，说明该传感器具有快速响应的特性。
测试例2
用实施例1的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制备的葡萄糖生物传感器对植物组织进行检测，分别取番茄果实和黄瓜果实作为待测样品。
1)前处理过程为：将果实用搅拌机粉碎并搅拌制成均匀果浆液，果实匀浆取10g，溶于100ml0.2mol/l铁氰化钾和1.2mol/l乙酸锌混合溶液中，过滤后获得澄清液，再用0.1mol/lnaoh水溶液调节滤液的ph值至7.4左右。将ph调节后溶液稀释10倍，即为待测溶液。
2)采用番茄和黄瓜作为实验对象，得到番茄果实和黄瓜果实的待测溶液。用制备的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，采用差分脉冲伏安法，对待测溶液进行检测，获得电流-电压曲线，取-0.4～-0.5v处的峰电流，扣减定标过程中的0mmol/l浓度葡萄糖溶液的峰电流(基准电流)，将所计算得到的电流值代入实施例1的定标函数中，转换可得果实待测溶液的葡萄糖浓度。
2.采用高效液相色谱对番茄果实和黄瓜果的待测溶液进行葡萄糖含量检测。表2为葡萄糖生物传感器和高效液相色谱检测的葡萄糖浓度。从表2中可知，nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的葡萄糖生物传感器的检测结果为：番茄待测样中葡萄糖含量为11.27mmol/l；黄瓜待测样中葡萄糖含量为5.66mmol/l。番茄待测样中葡萄糖含量的高效液相色谱检测结果为11.11mmol/l，黄瓜待测样中葡萄糖含量的高效液相色谱检测结果为5.56mmol/l。通过对比传感器和传统高效液相色谱方法在番茄和黄瓜果实的葡萄糖含量检测结果，可以得知传感器在葡萄糖含量检测方面具有高精确度，两种方式的检测结果误差在5％以内。因此，结果表明nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的葡萄糖生物传感器能够应用于番茄和黄瓜果实的葡萄糖含量检测。
表2葡萄糖生物传感器和高效液相色谱检测的葡萄糖浓度
综上所述，本发明nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极，制得的葡萄糖生物传感器具有高灵敏度(可达15.30μa(mmol/l)-1cm-2)、强抗干扰性和快速响应(可达2.8秒)；可用于植物组织中含量为0～20mmol/l葡萄糖的检测，传感器成本低，有利于民用化，具有很好的应用价值。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合和简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
1.一种nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极是将铂丝进行电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构，制得纳米多孔铂电极；再将所得纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，浸入到超声处理的氧化石墨烯水溶液中，采用循环伏安法将氧化石墨烯沉积到纳米多孔铂电极表面，制得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；然后将所得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极在0～4℃浸泡在葡萄糖氧化酶的pbs溶液中，在电极上固定葡萄糖氧化酶，制得葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；最后将nafion溶液滴涂到葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的表面，干燥制得。
2.根据权利要求1所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的纳米多孔铂电极是将打磨清洗后的铂丝电极作为阳极，石墨棒作为阴极接入直流电源，电源电压为20～30v，用nah2po4溶液作为电解液，在保持电解液的搅拌状态下，对铂丝进行电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构制得。
3.根据权利要求2所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的nah2po4溶液的浓度为0.1～1mol/l，所述的搅拌的速度为200～500r/min，所述的电化学腐蚀的时间为15～30min。
4.根据权利要求1所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的氧化石墨烯水溶液的浓度为0.5～5mg/ml，所述的葡萄糖氧化酶的pbs溶液的浓度为50～150unit/ml。
5.根据权利要求1所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的nafion溶液是将全氟磺酸溶解在乙醇中，所述的nafion溶液的浓度为0.5～1wt％。
6.根据权利要求1所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的循环伏安法的参数为：扫描速率0.5～1mv/s，扫描次数为4～22圈；高电位为0～-0.2v，低电位为-1～-1.2v；所述的沉积的时间为2～24h。
7.根据权利要求1所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极，其特征在于，所述的超声处理的时间为5～30min；所述的浸泡的时间为4～24h。
8.根据权利要求1-7任一项所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的制备方法，其特征在于，包括如下具体步骤：
s1.将打磨清洗后的铂丝电极作为阳极，石墨棒作为阴极接入直流电源，电源电压为20～30v，用nah2po4溶液作为电解液，在保持电解液的搅拌状态下，对铂丝进行15～30min的电化学腐蚀，在铂丝表面形成纳米多孔结构，制得纳米多孔铂电极；
s2.将所得纳米多孔铂电极作为工作电极，另一铂丝电极作为对电极，ag/agcl电极作为参比电极，组成三电极体系，将其插入到超声处理的氧化石墨烯水溶液中，采用循环伏安法将氧化石墨烯沉积到纳米多孔铂电极表面，沉积完成后，取出电极，用去离子水冲洗，再用氮气吹干，制得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；
s3.将所得氧化石墨烯/纳米多孔铂电极在0～4℃浸泡在葡萄糖氧化酶的pbs溶液中，进行葡萄糖氧化酶的吸附，在电极上固定葡萄糖氧化酶，制得葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极；
s4.将nafion溶液滴涂到葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极的表面，干燥，制得nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极。
9.权利要求1-7任一项所述的nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极制备的葡萄糖传感器在检测植物体内葡萄糖中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述的葡萄糖传感器是以nafion/葡萄糖氧化酶/氧化石墨烯/纳米多孔铂电极作为工作电极，铂丝作为对电极，ag/agcl作为参比电极。
技术总结