本发明属于蛋白质检测领域，具体涉及鉴别诊断梗阻性与非梗阻性无精子症精浆细胞外囊泡的生物标志物的应用。
背景技术：
无精子症在所有不孕男性中占约10%-15%，其在临床上通常分为梗阻性无精子症(oa)和非梗阻性无精子症(noa)两大类。oa患者睾丸内生精功能正常，但因男性生殖道阻塞如附睾、输精管或射精管病理性堵塞或先天性异常导致精子的运输发生障碍，约占所有无精子症病例的40%。noa是由睾丸功能衰竭引起的最严重的男性不育症之一。准确的诊断无精子症的分型是至关重要的，因为对于noa和oa的取精方式及治疗方法是不同的，oa患者一般通过精道再通术或附睾穿刺获得精子；noa患者则常通过睾丸显微取精技术获得精子然后实施辅助生殖。
生殖道手术探查与睾丸活检组织病理学检查仍然是鉴别无精子症的唯一方法，但它是一种侵入性、昂贵且复杂的程序。使用睾丸体积或血液生物标志物，如促卵泡激素(fsh)、抑制素b和抗苗勒氏激素，预测无精子症类分型，虽然有一定的效果，但其敏感性和特异性较低，限制了临床应用。精浆中含有来自睾丸、附睾和男性生殖腺体的液体，这些液体很容易获得，成为了生殖疾病潜在生物标志物的来源。然而，精液与其他体液一样存在大量高丰度蛋白，使得低丰度蛋白难以被检测分析。因此，开发一种无创性、高灵敏度和高特异性鉴别诊断无精子症的方法是很必要的。
细胞外囊泡(evs)是由所有类型的细胞分泌的直径为30-150nm的双层膜的小泡，内含多种蛋白质、核酸和其他生物分子，可以反应机体的病理生理状态。此外，evs因为其具有磷脂双分子层结构，不受循环中蛋白酶的影响，具有生物稳定性。多项研究表明，精液中含有大量的细胞外囊泡(se分钟alplasmaextracellularvesicles，sev)，sev的蛋白质组学研究表明，其有很大潜力成为如男性不育和前列腺癌等男性疾病的高特异性和可重复性的生物标志物。在本发明研究中，我们试图在sev中寻找发现重要的生物标志物，最终可以对其进行评估或监测，以达到鉴别性诊断无精子症分型的目的。
技术实现要素：
解决的技术问题：本发明针对上述现有无精子症临床诊断标志物的不足，提供一种精浆细胞外囊泡slc5a12(uniprotidq1ehb4)蛋白的应用。
技术方案：slc5a12蛋白在制备用于诊断区分非梗阻性无精子症与梗阻性无精子症产品中的应用。
slc5a12蛋白作为靶点在开发梗阻性无精子症检测试剂中的应用。
一种诊断区分非梗阻性无精子症与梗阻性无精子症的产品，包括slc5a12蛋白。
在本发明中，我们提供了一种差速离心富集sev的制备方法，该方法包括如下步骤：
（1）37℃液化30分钟的精液，3000rpm离心15分钟；
（2）取步骤（1）中1ml上清，4000g离心30分钟；
（3）取步骤（2）上清，20000g离心60分钟；
（4）取步骤（3）上清，199700g离心90分钟；
（5）弃步骤（4）上清，pbs重悬沉淀，再次199700g离心90分钟，弃上清得沉淀为sev。
基于此，我们对精子发生正常的健康个体(ns)，noa以及oa组中富集出的sev，基于串联质谱标签技术(tmt)结合超高分辨质谱仪进行蛋白表达定量分析，通过单因素方差分析发现49个蛋白在三组之间存在至少2倍的显著性差异。
对上述差异蛋白进行基因本体(go)分析，以及蛋白定位查询，通过筛选选取10个候选生物标志物以及1个无差异蛋白进行平行反应监测技术(prm)验证，验证发现附睾表达的slc5a12以100%特异性和100%敏感性区分oa和noa。
有益效果：本发明通过tmt标记技术对ns，noa和oa组的sev携带的蛋白质进行定量分析，鉴定组间差异蛋白，并采用prm技术成功验证出可用于诊断区分非梗阻性无精子症与梗阻性无精子症的生物标志物slc5a12。
附图说明
图1从ns、noa和oa患者中富集的sev的特性，其中a.免疫印迹显示从ns、noa和oa中分离的sev中cd81、tsg101、alix和calnexin的表达水平，并从精浆中以4000g离心30分钟所获得沉淀作为对照；b.纳米粒径分析测量ns、noa和oa患者sev的粒径分布；c.代表性的ns、noa和oa患者sev透射电镜图像，标尺为200nm。
图2为ns、noa和oa中sev的蛋白质组学分析，其中a.三组间sev差异蛋白的聚类分析图；b.图a聚类分析对应的go分析。
图3为在ns、noa和oa三组中验证sev差异蛋白，其中a.基于prm相对定量在ns、noa和oa三组中验证sev差异蛋白，无法被检测到的蛋白定量值显示为最低值0.0001，dnm1l蛋白作为三组间无差异阴性对照，***p≤0.001；**p≤0.01；*p≤0.05；b.通过免疫印迹技术验证slc512蛋白在ns、noa和oa三组中表达情况，细胞外囊泡的标志物alix作为内参。
图4为slc5a12在人睾丸和附睾中的定位情况，其中a.slc5a12在人睾丸和附睾中免疫印迹结果，gapdh作为内参;b.slc5a12在附睾头、体、尾的免疫组化定位，以igg为阴性对照。
caput-附睾头，标尺50μm；corpus-附睾体，cauda-附睾尾，标尺100μm。
图5为slc5a12蛋白在ns、noa和oa三组间sev绝对定量值及对应的受试者工作特征曲线(roc)结果，其中a-b.梯度稀释实验获得slc5a12蛋白最低检测下限(lod)，最低定量下限(loq)，lod和loq定义为目标蛋白在校准曲线上的最低浓度点，在这个点上重标同位素肽段峰形图的信噪比分别至少为3和10；c.slc5a12蛋白在ns、noa和oa三组间sev绝对定量值及对应的roc结果，***p≤0.001；**p≤0.01。
具体实施方式
下面通过具体实施例和附图对本发明的技术方案和技术效果作进一步详细说明。但本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。另外，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者，均按照本领域内的文献所描述的一般技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
实施例1.通过差速离心从精浆中富集细胞外囊泡
1、实验材料：
ns样本入组标准：根据世界卫生组织2010年指南，精液分析显示，精子数正常(≥15.0×106/ml)，ph值正常(7.20-8.00)，精子活力正常(32.0%-100%)。3次3000rpm离心15分钟无精子检出则认为是无精子症。noa入组标准：fsh>12iu/l且睾丸体积小于12ml或睾丸组织病理学显示精子发生减少或无生精细胞；排除标准：1）已知的获得性疾病，如化疗、双侧隐睾、睾丸扭转；2）遗传因素，如核型畸变、y染色体azf缺失。oa入组标准为睾丸穿刺或经皮附睾抽吸术(pesa)获得大量精子；先天性输精管缺如患者不纳入oa组。
2、实验过程：
（1）37℃液化30分钟后的精液，3000rpm离心15分钟；
（2）取步骤（1）中1ml上清，4000g离心30分钟；
（3）取步骤（2）上清，20000g离心60分钟；
（4）取步骤（3）上清，199700g离心90分钟；
（5）弃步骤（4）上清，用pbs重悬沉淀，再次199700g离心90分钟，弃上清得沉淀为sev；
（6）通过免疫印迹、纳米粒子轨迹、透射电子显微镜分析验证富集出的sev特征。
结果表明，从ns、noa和oa的精浆中富集的evs含有已知的evs的标志物cd9、alix、tsg101，同时缺乏evs不表达的蛋白calnexin(a)；纳米粒径分析显示sev大小主要分布在30-150nm（b）；电镜下sev呈现杯状或椭圆形的双分子层膜结构(c)(图1)。
实施例2.应用tmt标记技术定量ns、noa和oa三组sev蛋白表达情况
1、实验材料：
共检测了27例sev样本，分别为9例ns，9例noa和9例oa。
2、实验过程：
(1)在提取sev蛋白、胰蛋白酶酶解后，用tmt-10plex进行标记。然后采用watersm-classhplc液相系统对标记混合后的肽段样品进行高ph反相分离，分离后的各个组分分别通过easynlc1200(thermofisher)液相色谱在线分离并利用高分辨质谱仪orbitrapfusionlumos(thermofisher)进行检测。
(2)基于通用蛋白资源数据库(uniprot)(2018_07)中获得的人类蛋白序列并使用maxquant软件(1.6.5.0)对原始质谱文件进行检索。
(3)采用perseus软件进行单因素方差分析，组间蛋白差异倍数>2，且fdr-q≤0.05(permutation-basedcorrection）认为是差异蛋白，对差异蛋白进行聚类分析及go分析。
结果表明，鉴定出组间差异蛋白49个(a)，其可以进一步分成3类，聚类2(c2)中sev蛋白在对细菌和受精的防御反应方面表现出富集；聚类3(c3)差异sev蛋白主要富集于精子活力和atp生物合成过程(b)(图2）。
实施例3.应用prm相对定量技术在ns，noa和oa三组中验证sev差异蛋白
根据下述筛选条件对差异蛋白进行筛选：(1)ns>oa，noa>oa（2）差异蛋白具有特异肽段适合于prm试验。满足上述标准后，挑选了10个显著差异的sev蛋白以及1个无差异蛋白dnm1l作为对照进行靶向验证。
1、实验材料：
共验证了42例sev样本，分别为10例ns，23例noa和9例oa。
2、实验过程：
(1)设计靶蛋白的特异肽段，委托中国杰肽公司合成粗品的同位素标记重标肽段(heavy)。
(2)sev蛋白提取、胰蛋白酶酶解成肽段，在600ng的sev肽段中加入粗品的heavy，然后利用orbitrapfusionlumos(thermofisher)的prm模式进行采集。
(3)由步骤(2)得到prm验证的原始数据导入skylinedaily软件，定量数据均经过skyline软件进行标准化，检查目标肽段的峰形，判断谱图效果。导出目标肽段的定量信息，蛋白的定量值采用肽段加和的方式计算，并以light/heavy的比值作为相对定量值用于组间的统计分析。
(4)通过prm相对定量的筛选，我们发现筛选的10个候选蛋白基本上可以印证tmt结果，同时我们发现slc5a12可以区分全部的noa与oa样本(a)（图3）。
(5)应用免疫印迹技术验证slc512蛋白在ns、noa和oa三组中表达情况。
通过prm相对定量的验证筛选，以及免疫印迹技术再次验证，我们发现slc512在ns与noa样本中表达，而在oa样本中无法被检测到(b)（图3），其有可能成为较可信的区分noa与oa的标志物。
实施例4.slc5a12在人睾丸和附睾中的定位情况
为了更好地了解slc5a12在oa与noa鉴别诊断中的作用，我们进一步研究了它在人睾丸和附睾中的表达和定位。
1、实验材料
来自于手术活检附睾肿物的患者的附睾标本，来自睾丸活检的患者的睾丸样本。
2、实验过程
（1）通过免疫印迹技术显示slc5a12蛋白在人睾丸和附睾样本中表达情况。
（2）免疫印迹显示slc5a12在人附睾而不是人睾丸表达(a)（图4），因此我们接着用附睾样本进行免疫组化染色，揭示slc5a12在附睾中的具体定位情况。
免疫印迹显示slc5a12在人附睾而不是人睾丸表达(a)；免疫组化分析显示，slc5a12主要表达于附睾上皮细胞的管腔面顶膜上，其在附睾管头显示较低的信号，而在附睾体和尾显示较强的信号(b)（图4）。sev中的slc5a12可能由附睾上皮细胞分泌，因此，slc5a12在oa中几乎检测不到，而在noa和ns中则可以被检测到。
实施例5.prm绝对定量评价sev中slc5a12蛋白的诊断价值
为了在临床应用中获得更准确的基于质谱的slc5a12定量值，我们合成其纯品同位素重标肽段在54例sev样本中进行绝对定量。
1、实验材料：
共验证了54例sev样本，分别为12例ns，28例noa和14例oa。
2、实验过程：
(1)委托中国杰肽公司合成纯品(纯度>95%)的heavy。
(2)确立slc5a12蛋白对应重标肽段的最低检测下限(lod)值和最低定量下限(loq)，lod和loq和定义为目的蛋白对应峰形的信噪比分别为至少3和10。具体做法为对heavy进行梯度稀释，直至heavy无目标峰形出现，将原始质谱文件导入skyline软件进行分析，得到lod与loq值(a-b)(图5)。
(3)提取sev蛋白、胰蛋白酶解成肽段，在600ng的sev肽段中加入纯品同位素标记的重标肽段，然后经利用orbitrapfusionlumos(thermofisher)进行prm采集。
(4)由步骤(3)得到prm验证的原始质谱文件导入skyline软件进行分析，根据纯品同位素肽段上样的绝对质量计算出slc5a12在各组间的定量值，并绘制roc曲线。
结果表明sev中附睾表达的slc5a12以0.00243μg/mg(sev)为cut-off可以100%特异性和100%敏感性区分oa和noa(a-b)，roc曲线下面积为1(c)(图5)。
1.slc5a12蛋白在制备用于诊断区分非梗阻性无精子症与梗阻性无精子症产品中的应用。
2.slc5a12蛋白作为靶点在开发梗阻性无精子症检测试剂中的应用。
3.一种诊断区分非梗阻性无精子症与梗阻性无精子症的产品，其特征在于包括slc5a12蛋白。
技术总结