本发明涉及一种中药制剂中的氨基酸含量测定方法，特别涉及一种金水宝片的氨基酸含量测定方法。
技术背景
金水宝制剂为已经上市的产品，包括片剂，胶囊等剂型，其由发酵虫草菌粉(cs-4)填充而得，具有补益肺肾，秘精益气功能。用于肺肾两虚，精气不足，久咳虚喘，神疲乏力，不寐健忘，腰膝痠软，月经不调，阳痿早泄；慢性支气管炎、慢性肾功能不全、高脂血症、肝硬化见上述证候者。
“金水宝片质量标准的研究”《中草药》1999年07期许妍梅玲华公开了用薄层色谱法鉴别金水宝片中氨基酸、甘露醇，用反相高效液相色谱法测定其腺苷含量。
cn201310076926.4公开了一种金水宝制剂中氨基酸的含量测定方法，其采用高效液相色谱法。
现有金水宝制剂的质量标准主要包括核苷类、氨基酸类、甘露醇的薄层色谱鉴别和腺苷含量测定，其中氨基酸类鉴别包括亮氨酸、丙氨酸和缬氨酸的薄层色谱鉴别。研究表明，该制剂中氨基酸类有效成分还包括精氨酸、苏氨酸、脯氨酸、酪氨酸等，多达十余种，为更好地控制金水宝片的质量，有必要制定一种金水宝片中多种氨基酸成分的含量测定方法。
现有含有氨基酸产品的检测一般采用，高效液相-柱前衍生法，该方法衍生化条件不易，自动化程度不高，且衍生过过程中所用溶剂为剧毒性，为找到一种，自动化程度更高，衍生化条件更易控制，更安全灵敏度高，专属性强的检测方法，本发明通过对色谱条件的选择，以及对供试品溶液的配制方法的筛选，找到一种同时测定金水宝制剂中多种氨基酸的方法，和氨基酸自动分析仪-柱后衍生法相比，本发明方法精确度高，操作简单，只在一种色谱条件下即可检测出多种氨基酸，精密度，稳定性，重复性良好。
技术实现要素：
本发明的目的在于提供一种新的金水宝制剂的质量控制方法。为此，本发明提供一种同时测定金水宝制剂中多种氨基酸的方法。
已知，金水宝制剂含有几乎全部的人体必须氨基酸，如门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸，为对金水宝制剂的质量进行控制，找到一种一次性测定以上全部氨基酸的方法是本发明的任务，本发明经过筛选研究，找到一种技术解决方案。
为此，本发明提供一种采用氨基酸自动分析仪-柱后衍生法(原理是利用样品各种氨基酸组分的结构不同、酸碱性、极性及分子大小不同，在阳离子交换柱上将它们分离，采用不同ph值离子浓度的缓冲液将各氨基酸组分依次洗脱下来，再逐个以另一流路的茚酮试剂混合，然后共同流至螺旋反应管中，于一定温度下进行显色反应)对金水宝制剂中的氨基酸进行检测的方法。
本发明所述方法包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：称取金水宝制剂，将其制成粉末，加浓盐酸，充入氮气无氧加热水解，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容，取定容后的氨基酸水解液，用样品稀释液定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：精密称取各氨基酸对照品适量置同一容量瓶中，加入样品稀释液定容即得混合对照品溶液；
3)测定，将供试品溶液和对照品溶液分别注入氨基酸自动分析仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量。
其中氨基酸自动分析仪的色谱条件如下：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；按照以下条件进行梯度洗脱：
其中，所述稀释液的制备方法如下：称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚2.0g加适量水溶解后加入浓盐酸10.4ml，定容至1000ml，用氢氧化钠溶液调节ph值为2.2，即得。
其中，所需茚三酮溶液的制备方法如下：称取三水乙酸钠272.0g、醋酸钾196.0g，量取乙酸200ml，加适量水溶解后定容至1000ml即得钠钾缓冲液。称取茚三酮20.0g、苯酚2.0g，加入甲醇600ml，缓慢搅拌溶解后加钠钾缓冲液400ml混合，氮吹10min，再加入0.2g抗坏血酸后氮吹10min即得。
其中，各氨基酸对照品为：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的对照品，这些对照品可以从市场上购买得到，也可以按照现有技术制备得到，其纯度较高，一般大于98％重量百分比。
优选的，本发明的含量测定方法。包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：精密称取金水宝片粉末100mg置25ml水解管中，加入6mol/l盐酸溶液10ml后充氮气密封，置于烘箱中水解14～22h，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容至50ml。取定容后的氨基酸水解液2ml，用样品稀释液定容至10ml，即得供试品溶液。
2)对照品溶液的制备：精密称取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量置同一容量瓶中，加稀释液溶液定容即得混合对照品溶液。
3)分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液50μl，注入氨基酸自动分析仪，测定，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量。
色谱条件：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；梯度洗脱
根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝片，每片总氨基酸含量不少于50mg为合格品。
最优选的，本发明的检测方法，步骤如下：
1)供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝片约0.1g置25ml水解管中，加入6mol/l盐酸溶液10ml后充氮气密封，置110℃烘箱中水解18h，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容至50ml。取定容后的氨基酸水解液2ml，用样品稀释液定容至10ml，即得供试品溶液。
2)对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加样品稀释液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。
3)测定：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液50μl，注入氨基酸自动分析仪，测定，即得。
色谱条件：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；梯度洗脱
根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝片，每片总氨基酸含量不少于50mg为合格品。
本发明的测定方法是经过筛选获得的，筛选过程如下：
1样品处理条件的选择：
1.1水解温度考察
按供试品溶液的制备方法，分别考察了100℃、150℃、200℃的水解效果，结果如下表2。
表2水解温度考察结果
从实验结果可以看出110℃和120℃水解时的总面积都明显的大于100℃时，但110℃与120℃差别不大，且个别氨基酸随着温度的升高含量反而降低，综合考虑水解温度定为：110℃。
1.2水解时间考察按供试品溶液的制备方法，分别考察了14、16、18、20、22小时的水解效果，结果如下表3
表3水解时间考察结果
从总面积的结果可以看出，总面积与水解时间增加而扩大，在18-20分钟间达到顶点，综合考虑水解时间定为：18小时。
2精密度实验
按供试品溶液的制备方法制备1份供试品溶液，按色谱条件进样6次，测定，按峰面积分别计算rsd即得，天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的峰面积积分值，结果rsd分别为。0.76％、0.77％、0.74％、0.73％、0.61％、0.91％、0.67％、0.56％、0.69％、0.81％、0.89％、0.68％、0.72％、0.42％、0.50％、0.69％。表明仪器精密度良好。
3稳定性实验
按供试品溶液的制备方法制备1份供试品溶液，分别按0、2、4、8、16、24h六个时间点进样，测定，按峰面积分别计算rsd即得，别于0、2、4、8、12、24h进样，，测定各天冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的含量，其含量的rsd均分别为0.86％、1.07％、0.91％、0.93％、1.13％、1.73％、1.77％、1.68％、1.97％、1.74％、1.88％、1.75％、1.78％、1.77％、1.52％、1.49％，表明龟甲胶样品水解溶液在24h内稳定。
4重复性实验
按供试品溶液的制备方法平行置备6份供试品溶液，分别进样，测定，按峰折合面积分别计算rsd即得，计算测定各门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸精、精氨酸、脯氨酸的rsd分别为1.24％、1.07％、1.44％、1.11％、1.12％、1.46％、1.57％、1.79％、1.89％、1.63％、2.41％、1.85％、1.65％、1.17％、1.05％、1.08％。表明方法重复性良好。
5线性实验
将配制好的对照品溶液用样品稀释液稀释成系列浓度，按色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标(y)，质量浓度为横坐标(x)进行线性回归，建立各氨基酸的线性回归方程，结果见表4
表4氨基酸线性回归方程
6回收率实验
精密称取已知含量的样品0.1g，平行处理6份加入等量的对照品，按供试品溶液的制备方法制备供试品溶液，进样测定，记录峰面积，计算各氨基酸的加样回收率。结果表明，各氨基酸的平均加样回收率在98％～103％，rsd在0.33％～1.77％。结果各氨基酸rsd符合要求，回收率良好。
本发明质量控制方法对产品的质量控制更为有效，较现有方法准确度、灵敏度、稳定性均、安全性较高。本发明的方法既可以用于金水宝片，又可以用于其原料及其他制剂。
具体实施方式
以下通过实施例进一步说明本发明，但不作为对本发明的限制。
实施例1金水宝胶囊
处方：发酵虫草菌粉(cs-4)330g
制法：取发酵虫草菌粉(cs-4)，粉碎成细粉，装入胶囊，制成1000粒，即得。
质量控制方法：
供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝片约0.1g置25ml水解管中，加入6mol/l盐酸溶液10ml后充氮气密封，置110℃烘箱中水解18h，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容至50ml。取定容后的氨基酸水解液2ml，用样品稀释液定容至10ml，即得供试品溶液。
对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加样品稀释液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液。
色谱条件：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；梯度洗脱
表1流动相梯度比例
分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液50μl，注入氨基酸自动分析仪，测定，即得。根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝片，每片总氨基酸含量不少于50mg为合格品。
样品：为本公司生产的金水宝胶囊，规格为：0.42g/片，批号为：170811、170813、170814、170901、170902、170903、170904、170905、17096、170907，共十批，其包装均为市售包装。检测结果见表12。
表1210批样品测定结果
从结果可以看出，本实验方法重现性良好，可用于金水宝胶囊中氨基酸成分的含量测定。
1.一种金水宝制剂中氨基酸的含量测定方法，其特征在于，所述方法，步骤如下：
1)供试品溶液的制备：称取金水宝制剂，将其制成粉末，加浓盐酸，充入氮气无氧加热水解，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容，取定容后的氨基酸水解液，用样品稀释液定容，即得供试品溶液；
2)对照品溶液的制备：精密称取各氨基酸对照品适量置同一容量瓶中，加入样品稀释液定容即得混合对照品溶液；
3)测定，将供试品溶液和对照品溶液分别注入氨基酸自动分析仪，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量。
2.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中氨基酸自动分析仪的色谱条件如下：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；按照以下条件进行梯度洗脱：
其中，所述稀释液的制备方法如下：称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚2.0g加适量水溶解后加入浓盐酸10.4ml，定容至1000ml，用氢氧化钠溶液调节ph值为2.2，即得。
3.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，其中，在步骤中需要用到茚三酮溶液，所述茚三酮溶液的制备方法：称取三水乙酸钠272.0g、醋酸钾196.0g，量取乙酸200ml，加适量水溶解后定容至1000ml即得钠钾缓冲液，称取茚三酮20.0g、苯酚2.0g，加入甲醇600ml，缓慢搅拌溶解后加钠钾缓冲液400ml混合，氮吹10min，再加入0.2g抗坏血酸后氮吹10min即得。
4.如权利要求1所述的含，量测定方法，其特征在于，其中，各氨基酸对照品为：门冬氨酸、苏氨酸、丝氨酸、谷氨酸、甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、组氨酸、赖氨酸、精氨酸、脯氨酸的对照品，这些对照品可以从市场上购买得到，也可以按照现有技术制备得到，其纯度较高，一般大于98％重量百分比。
5.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，包括以下步骤：
1)供试品溶液的制备：精密称取金水宝片粉末100mg置25ml水解管中，加入6mol/l盐酸溶液10ml后充氮气密封，置于烘箱中水解14～22h，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容至50ml，取定容后的氨基酸水解液2ml，用样品稀释液定容至10ml，即得供试品溶液，
2)对照品溶液的制备：精密称取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量置同一容量瓶中，加稀释液溶液定容即得混合对照品溶液，
3)分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液50μl，注入氨基酸自动分析仪，测定，得到色谱图，根据色谱图计算每一种氨基酸的含量以及全部氨基酸的含量，
色谱条件：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；梯度洗脱
根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝片，每片总氨基酸含量不少于50mg为合格品。
6.如权利要求1所述的含量测定方法，其特征在于，步骤如下：
1)供试品溶液的制备：精密称取经匀质处理的金水宝片约0.1g置25ml水解管中，加入6mol/l盐酸溶液10ml后充氮气密封，置110℃烘箱中水解18h，取出后放至常温，将水解液用滤纸滤过并用水定容至50ml，取定容后的氨基酸水解液2ml，用样品稀释液定容至10ml，即得供试品溶液，
2)对照品溶液的制备：另取天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、甘氨酸、组氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、酪氨酸、缬氨酸、甲硫氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸对照品适量，加样品稀释液配制成浓度各为0.06、0.06、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.04、0.03、0.03、0.04、0.03、0.04、0.01、0.01、0.01mg/ml的混合溶液，作为对照品溶液，
3)测定：分别精密吸取对照品溶液及供试品溶液50μl，注入氨基酸自动分析仪，测定，即得，
色谱条件：lcak06/na离子柱；流动相：流动相a(称取二水合柠檬酸三钠11.8g、柠檬酸6.0g、苯酚0.5g，加适量水溶解，加甲醇65ml和浓盐酸5.6ml，用水定容至1000ml，naoh调ph至3.45)、流动相b(称取二水合柠檬酸三钠19.6g、氢氧化钠3.1g、硼酸5.0g，加适量水溶解并定容至1000ml，hcl调ph值至10.85)；梯度洗脱
根据本发明的测定方法，优选测定对象的金水宝制剂为金水宝片，每片总氨基酸含量不少于50mg为合格品。
技术总结