本发明涉及生物化学分析检测技术领域，具体涉及一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法。
技术背景
人体内1,5-脱水山梨醇()主要来自于常见食物，其分子结构与葡萄糖相似。闭合吡喃环结构保证了1,5-ag稳定存在于血液中，且不会被人体器官代谢。正常情况下，1,5-ag可通过葡萄糖重吸收通道sglt4被肾脏重吸收；因其进入尿液部分与摄入量相当，从而可保证其血液含量相对恒定。在高血糖病人(>180mg/dl)中，由于渗透压改变，肾脏对于葡萄糖的吸收功能受阻，肾脏中高葡萄糖含量竞争性抑制1,5-ag在肾小管的重吸收，从而导致大量1,5-ag随尿液排出。这种情况下血液中1,5-ag含量降低，尿液中含量升高。与糖化血红蛋白(hba1c)相比，1,5-ag能准确反映病人血糖前1-2周，甚至24小时以内的变化，也就是能准确测量出血糖的轻微波动。该方法与hba1c配合使用可以对血糖进行准确有效的监控。此外，2011年发表于atherosclerosis的一项来自日本的包含2000例样本以及11年随访的研究表明，1,5-ag可预测男性群体中心血管疾病(cardiovasculardiseases,cvd)风险。同时在2015年，美国约翰霍金斯大学研究者报道指出，1,5-ag血液含量较低的病人冠心病，中风和心衰的发病率升高，这些结果说明1,5-ag是糖尿病以及和糖尿病相关的心血管并发症重要的生物标志物之一。
综上，人体1,5-ag的升高或者降低与糖尿病甚至心血管类疾病风险息息相关，其在血浆中含量的高低对于评估人体健康是至关重要的。
技术实现要素：
本发明的目的是克服上述不足，提供了一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，该方法检测灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品预处理过程较简单，6min之内可完成1,5-脱水山梨醇的分离和检测，基质效应与精密度满足要求。
为实现上述目的，本发明提供如下方案，一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，包括以下步骤：
(1)、血浆样品预处理：向血浆样品中加入内标液b，再经振荡、离心，取上清液，即得经过预处理的血浆样品；
(2)、定性与定量检测：采用超高效液相色谱技术将经过预处理的血浆样品中的1,5-脱水山梨醇进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算待检测血浆样品中1,5-脱水山梨醇的含量，具体色谱条件为：
(a)超高效液相色谱条件：
流动相a：含有体积分数为0.0028％～0.005％甲酸和0.16～0.25mmol/l甲酸铵的超纯水；
流动相b：乙腈；
色谱柱的流速：0.3～0.5ml/min；
色谱柱的柱温：35～50℃；
色谱柱的进样体积：0.5～1.5μl；
采用梯度洗脱的方式；
(b)质谱条件：
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为2～3kv；去溶剂温度为110～130℃；雾化气温度为380～420℃，雾化气流速为780～820l/h，锥孔气流速为130～170l/h；同时监测了目标物1,5-脱水山梨醇(m/z162.90→100.88)以及同位素内标1,5-脱水山梨醇-13c6(m/z168.93→104.88)；
其中，目标物的多反应监测方法的参数为：
去簇电压：10v；
碰撞电压：13v；
保留时间(rt)：1.63min。
优选地，所述血浆样品为人或动物的血浆。
优选地，所述超高效液相色谱条件为：
流动相a：含有体积分数为0.004％甲酸和0.2mmol/l甲酸铵的超纯水；
流动相b：乙腈；
色谱柱的流速：0.4ml/min；
色谱柱的柱温：40℃；
色谱柱的进样体积：1μl；
采用梯度洗脱的方式。
优选地，所述色谱柱的型号为acquityuplcbehamide，所述色谱柱的规格为：长度100mm，内径2.1mm，颗粒直径为1.7μm。
优选地，色谱柱的梯度洗脱程序为：0～3min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；3～3.5min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；3.5～6min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；6min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；其中，梯度洗脱程序中流速保持不变。
优选地，所述质谱条件为：喷雾电压为2.5kv；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h。
优选地，所述经过预处理的血浆样品按照如下方法制备得到：取20μl血浆加入离心管中，向其中加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液，即得经过预处理的血浆样品。
优选地，所述内标液b按照如下方法制备得到：取25.00mg同位素内标品1,5-脱水山梨醇-13c6，加入1.471ml体积分数为50％的甲醇完全溶解，得到浓度为100mmol/l的同位素内标溶液，然后用体积分数为50％的甲醇将该同位素内标溶液的浓度稀释至1mmol/l，得到内标液a，取10μl内标液a加入至20ml乙腈溶液中，即得内标液b。
与现有相比，本发明的有益效果在于：本发明方法灵敏度高、特异性强、准确且血浆样品预处理过程较简单，6min之内可完成1,5-脱水山梨醇的分离和检测，基质效应与精密度满足要求，可用于临床上1,5-脱水山梨醇的定性和定量分析，为临床上糖尿病风险和心血管疾病风险的健康评估提供一种可靠的检测方法。
附图说明
图1为实施例中标准品中1,5-脱水山梨醇及其同位素内标物的总离子流色谱图。
图2为实施例中血浆样品中1,5-脱水山梨醇及其同位素内标物的总离子流色谱图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例
本实施例中的血浆样品来自武汉亚洲心脏病医院2017年12月份门诊收集的血浆样本。
本实施例中所采用的仪器包括xevotq-s三重四级杆质谱仪(waterscorporation)；uplci-class超高效液相色谱系统(配自动进样器，waterscorporation)；scilogexd2012高速台式离心机(美国)；超纯水仪(elgalabwater，英国)；多管涡旋混合仪(vortexgenie2，美国)；可调移液器(eppendorf0.5～10μl，10～100μl，100～1000μl)。
本实施例中的试剂耗材包括：色谱纯乙腈(honeywell，美国)；ms级乙腈(fisher，美国)；ms级甲酸、甲酸铵(merck，美国)；牛血清白蛋白(bsa)(merck，美国)；色谱柱watersbehamide,1.7μm,2.1x100mm(waterscorporation)。
本实施例中的标准品：1,5-ag购自merck公司，1,5-ag-13c6购自omicronbiochemicals公司，纯度均≥98％。
本实施例中的质控品：含有1,5-ag分子的空白血浆基质溶液，分低中高三个浓度分别为qc(l)、qc(m)、qc(h)，见表1所示。
表11,5-脱水山梨醇质控品对应浓度(单位μm)
本实施例提供一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，包括以下步骤：
(1)、血浆样品预处理：取20μl血浆加入1.5ml的离心管中，向其中加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液，即得经过预处理的血浆样品，待用；
其中，内标液b按照如下方法制备得到：取25.00mg同位素内标品1,5-脱水山梨醇-13c6，加入1.471ml体积分数为50％的甲醇完全溶解，得到浓度为100mmol/l的同位素内标溶液，然后用体积分数为50％的甲醇将该同位素内标溶液的浓度稀释至1mmol/l，得到内标液a，取10μl内标液a加入至20ml乙腈溶液中，即得内标液b。
(2)、定性与定量检测：采用超高效液相色谱串联质谱技术将经过预处理的血浆样品中的1,5-脱水山梨醇进行分离，超高效液相色谱的条件为：色谱柱的型号为acquityuplcbehamide，色谱柱的规格为：长度100mm，内径2.1mm，颗粒直径为1.7μm，色谱柱的流速为0.4ml/min，色谱柱的柱温为40℃，色谱柱的进样体积为1μl；色谱流动相中的流动相a为含有体积分数为0.004％甲酸和0.2mmol/l甲酸铵的超纯水，色谱流动相中的流动相b为乙腈；色谱柱的梯度洗脱程序为：0～3min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；3～3.5min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；3.5～6min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；6min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；其中，梯度洗脱程序中流速保持不变。
再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算待检测血浆样品中1,5-脱水山梨醇的含量；
质谱条件为：在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为2～3kv；去溶剂温度为110～130℃；雾化气温度为380～420℃，雾化气流速为780～820l/h，锥孔气流速为130～170l/h；同时监测了目标物1,5-脱水山梨醇(m/z162.90→100.88)以及同位素内标1,5-脱水山梨醇-13c6(m/z168.93→104.88)。其中，目标物的去簇电压和碰撞电压参数见表2。
表21,5-脱水山梨醇检测质谱参数
标准品的配制：准确称取1,5-脱水山梨醇7.101mg，加入4.326ml的50％甲醇，配制成浓度为10mmol/l的标准品母液；
标准品的处理：取10μl标准品母液加入至190μl空白血浆基质溶液中作为第一个高值浓度点；取100μl第一高值浓度点用等体积空白血浆基质溶液稀释得第二高值浓度点，然后使用1倍体积的空白血浆基质溶液进行逐级稀释，得其他六个校准浓度点。每个浓度点样品取20μl分装，加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液移入色谱瓶中上样进行lc-ms/ms分析。
质控品的配制：取标准品母液1μl、5μl、40μl分别用空白血浆基质溶液定容至1000μl分别得到质控品溶液qc(l)、qc(m)、qc(h)。
质控品的处理：分别取配制的质控品溶液qc(l)，qc(m)，qc(h)各20μl于1.5ml离心管中，再向其中加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液，最后移入色谱瓶中上样进行lc-ms/ms分析。
其中，本实施例中的空白血浆基质为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液。
超高效液相色谱系统-质谱仪中试剂盒上下四周加膜，防震保温，左上方放置流动相a和b，左下方分别放置4*1ml安瓿瓶，分别为标准液和质控品；右边分别放置10ml稀释液和100m萃取液。分析试剂盒中各组分见表3。
表31,5-脱水山梨醇分析试剂盒组分的制备
测试结果：
(1)总离子流色谱图：1,5-脱水山梨醇的标准品和血浆样品的峰形比较对称，且没有杂峰干扰，说明在此条件下能够得到良好的检测，图1为1,5-脱水山梨醇及其同位素内标的总离子流色谱图，图2为血浆中1,5-脱水山梨醇及其同位素内标的总离子流色谱图。
(2)基质效应(matrixeffect，me)和提取回收率(extractionefficiency，ee)考察：由于本实验空白血浆基质为50mg/ml牛血清白蛋白水溶液(5％bsa)，且定量标准曲线由5％bsa配制而得，因此对5％bsa和血浆均进行基质效应和提取回收率考察，基质效应由提取后基质加标和同浓度标样纯溶液相比较而得，浓度越高，基质效应的影响越小，因此高浓度只考察了提取回收率(浓度越高，提取回收率可能越小)。在同浓度标样纯溶液采用id-uplc-ms/ms测试得到峰面积—a，提取后基质加标的溶液采用id-uplc-ms/ms测试得到峰面积—b，基质效应me(％)＝b/a×100。
测试结果如表4和表5所示。测试结果显示：1,5-脱水山梨醇在5％bsa中几乎无基质效应(低浓度和高浓度均在85％～115％之间)，且提取回收率较高(≥80％)；同样，1,5-脱水山梨醇在血浆中的基质效应经内标校正后，也在85％-115％之间；且高浓度样品提取回收率在80％以上。
表41,5-脱水山梨醇在5％bsa中基质效应和提取回收率结果
表51,5-脱水山梨醇在血浆中基质效应和提取回收率结果
(3)标准曲线：采用同位素内标定量法，利用targetlynx软件以标准物与内标物的浓度比为x轴，标准物与内标物峰面积比为y轴，建立校准曲线，并计算出血浆中待测物的浓度。1,5-脱水山梨醇在各自浓度范围内的线性拟合方程，线性良好，相关系数在0.998以上，满足定量要求，见表6。
表61,5-脱水山梨醇线性回归方程及线性相关系数
(4)精密度试验：取正常人血浆样品一天内重复处理8批，以同位素内标法定量测定1,5-脱水山梨醇的浓度，批内精密度为6.25％，结果见表7；三日内分3批处理，计算批间精密度为6.32％，结果见表8。
表7批内精密度试验结果(单位μm)
表8批间精密度试验结果(单位μm)
本发明超高效液相色谱串联质谱方法测定了人体血浆中的1,5-脱水山梨醇(1,5-anhydroglucitol,1,5-脱水山梨醇)。同时针对目标物的出峰时间和离子对进行检测，灵敏度高，与此同时，采用同位素内标法定量可以极大的消除基质干扰，而且不受预处理过程、上样体积和流动相等条件的影响，能够达到准确定量。
考察了1,5-脱水山梨醇在5％bsa和血浆中的基质效应及提取回收率，1,5-脱水山梨醇在5％bsa中几乎无基质效应(低浓度和高浓度均在85％-115％之间)，且提取回收率较高(≥80％)；同样，1,5-脱水山梨醇在血浆中的基质效应经内标校正后，也在85％-115％之间；且高浓度样品提取回收率在80％以上。说明5％bsa可作为空白血浆替代基质，用于血浆中1,5-脱水山梨醇的准确定量。
方法的重现性结果表明，1,5-脱水山梨醇日内精密度为6.25％，日间精密度为6.32％，方法的重现性良好。实验为了得到更加稳定且灵敏度高的目标物信号，考察了不同流动相及电解质的种类和浓度，并尽可能实现化合物和基质干扰的基线分离。且建立的血浆样品预处理过程非常简单，蛋白沉淀一步到位，血浆用量仅20μl。
本发明中的方法灵敏度高、特异性强、准确且前处理过程较简单，6min之内可完成化合物的分离和检测，基质效应、提取回收率以及精密度满足要求，可用于临床上血浆1,5-脱水山梨醇的定量分析，为临床上糖尿病风险和心血管疾病风险的健康评估提供一种可靠的检测方法。
以上应用了具体个例对本发明进行阐述，只是用于帮助理解本发明，并不用以限制本发明。对于本发明所属技术领域的技术人员，依据本发明的思想，还可以做出若干简单推演、变形或替换。
1.一种超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)、血浆样品预处理：向血浆样品中加入内标液b，再经振荡、离心，取上清液，即得经过预处理的血浆样品；所述内标液b由同位素内标品1,5-脱水山梨醇-13c6、甲醇及乙腈溶液制备而成；
(2)、定性与定量检测：采用超高效液相色谱技术将经过预处理的血浆样品中的1,5-脱水山梨醇进行分离，再利用质谱同位素内标定量法，以标准品与内标物的浓度比为x轴，标准品与内标物的峰面积比为y轴，建立校准曲线，计算待检测血浆样品中1,5-脱水山梨醇的含量，具体色谱条件为：
(a)超高效液相色谱条件：
流动相a：含有体积分数为0.0028％～0.005％甲酸和0.16～0.25mmol/l甲酸铵的超纯水；
流动相b：乙腈；
色谱柱的流速：0.3～0.5ml/min；
色谱柱的柱温：35～50℃；
色谱柱的进样体积：0.5～1.5μl；
采用梯度洗脱的方式；
(b)质谱条件：
在电喷雾电离负离子检测模式下，采用多反应监测的质谱扫描模式；喷雾电压为2～3kv；去溶剂温度为110～130℃；雾化气温度为380～420℃，雾化气流速为780～820l/h，锥孔气流速为130～170l/h；同时监测了目标物1,5-脱水山梨醇(m/z162.90→100.88)以及同位素内标1,5-脱水山梨醇-13c6(m/z168.93→104.88)；
其中，目标物的多反应监测方法的参数为：
去簇电压：10v；
碰撞电压：13v；
保留时间(rt)：1.63min。
2.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述血浆样品为人或动物的血浆。
3.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述超高效液相色谱条件为：
流动相a：含有体积分数为0.004％甲酸和0.2mmol/l甲酸铵的超纯水；
流动相b：乙腈；
色谱柱的流速：0.4ml/min；
色谱柱的柱温：40℃；
色谱柱的进样体积：1μl；
采用梯度洗脱的方式。
4.如权利要求3所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述色谱柱的型号为acquityuplcbehamide，所述色谱柱的规格为：长度100mm，内径2.1mm，颗粒直径为1.7μm。
5.如权利要求3所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，色谱柱的梯度洗脱程序为：0～3min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；3～3.5min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；3.5～6min，流动相a的体积分数为70％，流动相b的体积分数为30％；6min，流动相a的体积分数为15％，流动相b的体积分数为85％；其中，梯度洗脱程序中流速保持不变。
6.如权利要求3所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述质谱条件为：喷雾电压为2.5kv；去溶剂温度为120℃；雾化气温度为400℃，雾化气流速为800l/h，锥孔气流速为150l/h。
7.如权利要求1-6任一项所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述经过预处理的血浆样品按照如下方法制备得到：取20μl血浆加入离心管中，向其中加入1200μl内标液b，然后涡旋数秒后振荡10min，15000r/min离心10min后取70μl上清液，即得经过预处理的血浆样品。
8.如权利要求1所述的超高效液相色谱串联质谱检测血浆中1,5-脱水山梨醇的方法，其特征在于，所述内标液b按照如下方法制备得到：取25.00mg同位素内标品1,5-脱水山梨醇-13c6，加入1.471ml体积分数为50％的甲醇完全溶解，得到浓度为100mmol/l的同位素内标溶液，然后用体积分数为50％的甲醇将该同位素内标溶液的浓度稀释至1mmol/l，得到内标液a，取10μl内标液a加入至20ml乙腈溶液中，即得内标液b。
技术总结